荔枝乳酸菌饮品发酵菌种筛选及其发酵特性分析

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刘 欣，刘 芸，陈梅春，郑雪芳，陈 峥，王阶平，刘 波

(福建省农业科学院农业生物资源研究所， 福建 福州 350003)

我国是世界上荔枝生产的第一大国，产量占世界的80%。福建是我国荔枝第三大产区，种植历史悠久，品种资源丰富(50多个品种)，种植面积3.58万hm2，总产量11.8万t。由于荔枝产期集中，含糖量高，保鲜储运困难，近年来，荔枝价格一路走低，严重影响了荔枝产业的发展，寻求荔枝乳酸菌饮品等深加工成为趋势[1]。荔枝乳酸菌饮品的研究有过许多报道，邹颖等[2]报道了酵母菌乳酸菌共发酵对荔枝汁品质的影响；
刘欣等[3]报道了不同乳酸菌荔枝汁发酵特性及其贮藏稳定性；
吴倩等[4]报道了不同乳酸菌对凝固型荔枝酸奶的发酵特性和质构的影响；
卢嘉懿等[5]报道了乳酸菌发酵对荔枝汁中γ-氨基丁酸含量的影响；
郑巨等[6]报道了喷雾干燥条件对荔枝酸奶粉乳酸菌存活率及粉体特性的影响；
孙淑夷[7]研究了荔枝汁混菌发酵工艺及其功能活性成分；
移兰丽等[8]报道了荔枝风味物质分析及其乳酸菌发酵饮料。

然而，不同的乳酸菌对荔枝汁的发酵适应性不同，郑欣等[9]向鲜榨并经巴氏灭菌的荔枝汁中接入不同的乳酸菌(干酪乳杆菌、肠膜状明串珠菌、乳酸链球菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌)进行发酵，结果表明肠膜状明串珠菌的生长速率略高于其他5种菌。荔枝汁乳酸菌发酵过程生长能力、发酵周期差异、活菌数动态等特性，影响着荔枝汁乳酸菌的发酵，但未见相关研究的报道。

本研究选择了8种乳酸菌(植物乳杆菌FJAT-13737、德氏乳杆菌FJAT-43773、副干酪乳杆菌FJAT-13741、鼠李糖乳杆菌FJAT-13807、短乳杆菌FJAT-43776、发酵乳杆菌FJAT-13771、嗜酸乳杆菌FJAT-13772、嗜热链球菌FJAT-43774)，比较分析其在荔枝乳酸菌饮品培养基配方中的发酵特性，从菌种发酵能力、发酵周期差异、活菌数时间分布均匀性等方面，评判乳酸菌发酵水平，筛选适合于荔枝乳酸菌饮品发酵的菌种。

1.1 试验材料

1.1.1菌种选择 从保存在福建省农业科学院农业生物资源研究所微生物保存中心，选择《可用于食品的菌种名单》里列出的乳酸菌8株，作为试验菌种，包括：植物乳杆菌FJAT-13737(LactobacillusplantarumFJAT-13737)、德氏乳杆菌FJAT-43773(L.delbrueckiiFJAT-43773)、副干酪乳杆菌FJAT-13741(L.paracaseiFJAT-13741)、鼠李糖乳杆菌FJAT-13807(L.rhamnosusFJAT-13807)、短乳杆菌FJAT-43776(L.brerisFJAT-43776)、发酵乳杆菌FJAT-13771(L.fermentumFJAT-13771)、嗜酸乳杆菌FJAT-13772(L.acidophilusFJAT-13772)、嗜热链球菌FJAT-43774(StreptococcusthermophilusFJAT-43774)。

1.1.2乳酸菌培养基 (1)LBS琼脂培养基，用于菌种活化，购于北京陆桥公司。(2)MC培养基，用于种子制作，配方：大豆蛋白胨5.0 g、牛肉浸粉3.0 g、酵母浸粉3.0 g、葡萄糖20.0 g、乳糖20.0 g、碳酸钙10.0 g、琼脂18 g，蒸馏水1 000 mL，1%中性红溶液5.0 mL，pH 6.4±0.2，121℃高压灭菌15 min。(3)MRS培养基，用于活菌计数，配方：蛋白胨10.0 g、牛肉浸粉5.0 g、酵母浸粉4.0 g、葡萄糖20.0 g、吐温-80 1.0 mL、磷酸氢二钾2.0 g、乙酸钠5.0 g、柠檬酸三铵2.0 g、硫酸镁0.2 g、硫酸锰0.05 g、琼脂 18 g，蒸馏水1 000 mL，pH 6.4±0.2，121℃高压灭菌15 min。

1.1.3荔枝乳酸菌饮品发酵培养基 荔枝汁的制备，选取新鲜荔枝，洗净去皮核，将果肉榨汁过滤备用。大豆蛋白(豆浆)的制备，黄豆用蒸馏水浸泡10 h后清洗，加入干重20倍的纯净水，磨浆去渣备用。荔枝乳酸菌饮品发酵培养基制备，将荔枝汁和豆浆按1∶1比例混合，加入2%的白砂糖，分装于250 mL蓝盖瓶中，每瓶200 mL，灭菌，备用。

1.2 试验方法

1.2.1荔枝乳酸菌饮品发酵 分别选择上述8个菌种，制作发酵种子，浓度调节到1×108cfu·mL-1，以5%接菌量分别接种于荔枝乳酸菌饮品发酵培养基，置于37℃培养箱培养48 h，1 h开始第1次取样，而后每6 h取样1次，分析发酵液活菌数。

1.2.2乳酸菌培养过程活菌计数 乳酸菌发酵过程的活菌数统计采用稀释平板计数法进行[3]，每6 h取样1次(1、6、12、18、24、30、36、42、48 h，共计9次)的发酵液，吸取1 mL样品加入99 mL的无菌水中，即配成10-2浓度；
用移液枪吸取1 mL 10-2浓度液体至装有9 mL无菌水的试管，即配成10-3浓度，以此类推，配制10-4、10-5、10-6浓度发酵液，进行平板涂布；
超净台上无菌操作，溶液在振荡器上振荡10 s，吸取200 μL至相应浓度的平板上，溶液滴至平板中央，用涂布棒涂匀并静置1 h，使溶液完全渗透进平板中。每个浓度梯度重复3次。将涂好的平板用塑料袋装好倒置于恒温箱中37℃培养3 d。统计培养平板上菌落数，算出同一稀释度的菌落平均数，按公式：每毫升样品中活菌数=同一稀释度的菌落平均数×稀释倍数×10。

1.3 数据统计

1.3.1乳酸菌发酵过程生长特性的比较 统计不同乳酸菌发酵过程活菌数，进行活菌数、生长周期差异、生长曲线分析。

1.3.2乳酸菌发酵过程活菌数时间分布均匀性的比较 统计不同乳酸菌不同发酵时间的活菌数变化，进行发酵过程活菌数时间分布均匀性分析，采用优势度指数Simpson(D)、香农指数Shannon(H)、均匀度指数Evenness构建活菌数分布多样性指数进行比较，分析软件为DPS数据处理平台[10]。

1.3.3乳酸菌发酵过程聚类分析 利用不同乳酸菌不同发酵时间活菌数为矩阵，乳酸菌聚类分析以乳酸菌为样本，发酵时间为指标；
发酵周期聚类分析以发酵时间为样本，乳酸菌为指标；
利用马氏距离为尺度，数据不转换，可变类平均法进行系统聚类。分析软件为DPS 9.5数据处理平台[10]。

2.1 乳酸菌发酵过程生长特性的比较

2.1.1活菌数的比较 由表1可知，发酵过程不同乳酸菌发酵能力存在差异。从菌株上看，鼠李糖乳杆菌FJAT-13807发酵水平最高，1～48 h活菌数的总和为562.90×107cfu·mL-1，其次为短乳杆菌FJAT-43776(352.13×107cfu·mL-1)>发酵乳杆菌FJAT-13771(337.90×107cfu·mL-1)>德氏乳杆菌FJAT-43773(266.59×107cfu·mL-1)>副干酪乳杆菌FJAT-13741(167.64×107cfu·mL-1)>植物乳杆菌FJAT-13737(101.92×107cfu·mL-1)>嗜酸乳杆菌FJAT-13772(44.84×107cfu·mL-1)>嗜热链球菌FJAT-43774(29.7×107cfu·mL-1)，最大值和最小值之间相差18.88倍。从发酵时间看，8个乳酸菌活菌数总和代表了乳酸菌数量时间动态分布特性，从1 h的12.18 ×107cfu·mL-1上升到24 h的峰值683.00×107cfu·mL-1，随后逐渐下降到48 h的167.22×107cfu·mL-1。活菌数反映了乳酸菌的发酵能力，可以作为发酵菌种选择的参考指标之一。

表1 不同乳酸菌发酵过程活菌数的比较

2.1.2生长周期的比较 由表2可知，乳酸菌在荔枝乳酸菌饮品培养基中生长周期经历适应期、对数期、稳定器、消亡期。不同的乳酸菌不同生长周期长短不同，有的种类适应期长，消亡期靠后，如植物乳杆菌FJAT-13737适应期长(1～18 h)、对数期短(19～30 h)、稳定期短(31～42 h)、消亡期靠后(49 h后)；
有的种类适应期短，消亡期靠前，如发酵乳杆菌FJAT-13771适应期短(1～6 h)、对数期较长(7～24 h)、稳定期较长(25～42 h)、消亡期靠前(43 h以后)。不同种类乳杆菌生长周期的差异反映了其生物学特性的差异，对于了解乳杆菌的生长特性具有重要意义。

表2 不同乳酸菌在荔枝乳酸菌饮品培养基中生长周期的划分

2.1.3生长曲线的比较 由图1可知，可将生长曲线分为2个类型，第一类型为中峰型，活菌数峰值出现在24 h，属于第1类的菌种有短乳杆菌FJAT-43776、发酵乳杆菌FJAT-13771、嗜酸乳杆菌FJAT-13772、嗜热链球菌FJAT-43774；
第2类型为后峰型，活菌数峰值出现在30 h以后，属于第2类的菌种有植物乳杆菌FJAT-13737、德氏乳杆菌FJAT-43773、副干酪乳杆菌FJAT-13741、鼠李糖乳杆菌FJAT-13807。从发酵行为看，可分为3个类型，第1类型活菌数峰值较高，达峰值后活菌数下降较慢，如鼠李糖乳杆菌FJAT-13807峰值在36 h达120.00 ×107cfu·mL-1，而后活菌数下降较慢回落到48 h的63.00×107cfu·mL-1；
第2类型活菌数峰值较高，达峰值后活菌数迅速下降，如短乳杆菌FJAT-43776峰值在24 h达340.00×107cfu·mL-1，随后在30 h迅速下降到0.40×107cfu·mL-1；
第3类型活菌数峰值较低，达峰值后活菌数迅速下降，如嗜热链球菌FJAT-43774峰值在24 h仅为16.00×107cfu·mL-1，随后在30 h活菌数迅速下降到0.10×107cfu·mL-1。

图1 乳酸菌在荔枝乳酸菌饮品培养基中生长曲线

2.2 乳酸菌发酵过程活菌数分布均匀性和多样性分析

2.2.1活菌数时间分布均匀性的比较 从图2可知，不同乳酸菌不同的生长时间活菌数含量不同。短乳杆菌FJAT-43776和发酵乳杆菌FJAT-13771，活菌数时间分布不均匀，发酵前期活菌数非常少，发酵到24 h时，活菌数达峰值，分别为340.00×107、130.00×107cfu·mL-1，随后活菌数迅速下降。鼠李糖乳杆菌FJAT-13807、植物乳杆菌FJAT-13737、德氏乳杆菌FJAT-43773、副干酪乳杆菌FJAT-13741发酵过程，0～48 h活菌数时间分布较为均匀，表明这些菌株的生长持续性较好。嗜酸乳杆菌FJAT-13772和嗜热链球菌FJAT-43774生长能力差，活菌数时间分布也不均匀。活菌数时间分布均匀性反映了乳酸菌发酵启动的时间和持续的程度，可以作为选择乳酸菌性能考察的指标之一。

注：A为植物乳杆菌FJAT-13737；
B为德氏乳杆菌FJAT-43773；
C为副干酪乳杆菌FJAT-13741；
D为鼠李糖乳杆菌FJAT-13807；
E为短乳杆菌FJAT-43776；
F为发酵乳杆菌FJAT-13771；
G为嗜酸乳杆菌FJAT-13772；
H为嗜热链球菌FJAT-43774。

2.2.2活菌数分布多样性指数的比较 由表3可知，不同乳酸菌活菌数分布多样性指数(优势度指数、香农指数、均匀度指数)差异显著，如鼠李糖乳杆菌FJAT-13807活菌数分布多样性指数(优势度指数=0.86、香农指数=2.00、均匀度指数=0.91)显著地高于短乳杆菌FJAT-43776(优势度指数=0.07、香农指数=0.20、均匀度指数=0.09)，表明前者发酵过程活菌数分布较为均匀，后者分布不均匀。活菌数分布多样性指数较高(优势度指数>0.80、香农指数>1.75、均匀度指数>0.80)的乳酸菌有鼠李糖乳杆菌FJAT-13807、德氏乳杆菌FJAT-43773、副干酪乳杆菌FJAT-13741，发酵过程活菌数分布较为均匀，其余种类活菌数指数较低，发酵过程活菌数分布不均匀。

表3 荔枝乳酸菌饮品培养基发酵过程活菌数分布多样性指数的比较

2.3 乳酸菌发酵过程聚类分析

2.3.1乳酸菌聚类分析 以表1数据为矩阵，乳酸菌为样本，发酵天数为指标，数据不转换，马氏距离为尺度，用可变类平均法进行聚类分析。结果表明，可将乳酸菌发酵过程分为3组，第1组为生长能力较强，活菌数时间分布较均匀的类型，包括了鼠李糖乳杆菌FJAT-13807、植物乳杆菌FJAT-13737、德氏乳杆菌FJAT-43773、副干酪乳杆菌FJAT-13741；
第2组为生长能力中等，活菌数时间分布不均匀的类型，包括了短乳杆菌FJAT-43776、发酵乳杆菌FJAT-13771；
第3类为生长能力较弱，活菌数时间分布不均匀类型，包括了嗜酸乳杆菌FJAT-13772、嗜热链球菌FJAT-43774。

图3 基于荔枝乳酸菌饮品培养基发酵过程的乳酸菌聚类分析

2.3.2发酵时间聚类分析 以表1为矩阵，发酵天数为样本，乳酸菌活菌数为指标，数据不转换，马氏距离为尺度，用可变类平方发进行聚类。结果表明，综合8个乳酸菌发酵过程，总体可将乳酸菌发酵时间分为4组，第1组为适应期，包括了1～12 h的发酵周期；
第2组为对数期，包括了18～24 h发酵周期，第3组为稳定期，包括了30～36 h的发酵周期；
第4组为衰亡期，包括了42～48 h的发酵周期。总体上为乳酸菌的生长周期的划分提供参考。

图4 基于荔枝乳酸菌饮品培养基乳酸菌生长的发酵时间聚类分析

植物蛋白替代动物蛋白研制乳酸菌饮品成为趋势[11]，发达国家利用植物蛋白解决“文明病”问题，即预防高胆固醇、高血脂等心血管疾病；
发展中国家则利用植物蛋白解决“蛋白质不足”问题[12]。乳酸菌发酵植物基饮料菌种筛选十分重要[13]。王鑫等[14]报道红枣发酵饮料适应于以干酪乳杆菌∶植物乳杆菌∶鼠李糖乳杆菌=6∶1∶1比例复配菌种发酵；
胡耀辉等[15]乳酸菌在豆奶中的驯化及生长特性，将鼠李糖乳杆菌、嗜热链球菌、两歧双歧杆菌和保加利亚乳杆菌4种乳酸菌,接在豆浆和牛奶不同比例组成的培养基中进行驯化，结果表明:鼠李糖乳杆菌、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌,在100%豆浆中不能稳定的传代,从第二代就开始生长缓慢,并且接种生长到菌体开始自溶的时间短;在豆浆含量为80%时,可以稳定的传代,生长良好;而两歧双歧杆菌可以适应100%豆浆,在其中可以稳定传代,生长良好。陈晓维等[16]筛选适应冬瓜汁发酵的乳酸菌，接入不同的乳酸菌(干酪乳杆菌、嗜热链球菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、双歧杆菌和保加利亚乳杆菌)，结果表明，上述各种乳酸菌均能在冬瓜汁中很好地生长,双歧杆菌的产酸能力最强。郑欣等[9]筛选适应于荔枝汁发酵的乳酸菌，结果表明，接入6种乳酸菌(干酪乳杆菌、肠膜状明串珠菌、乳酸链球菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌)均能在荔枝汁中很好地生长,其中肠膜状明串珠菌的生长速率略高于其他5种菌。刘欣等[3]比较了不同乳酸菌对荔枝汁发酵效果，结果表明植物乳杆菌、德氏乳杆菌发酵水平较高，嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、发酵乳杆菌发酵水平较低。不同的乳酸菌对不同的植物原料发酵的互为适应性差异显著[17]。

本研究中荔枝乳酸菌发酵饮品(配方荔枝汁50%+大豆蛋白48%+白砂糖2%)也显示菌种发酵能力的差异，8种乳酸菌发酵能力研究结果可将其分为3组，第1组为生长能力较强，活菌数时间分布较均匀的类型，包括了鼠李糖乳杆菌FJAT-13807、植物乳杆菌FJAT-13737、德氏乳杆菌FJAT-43773、副干酪乳杆菌FJAT-13741；
第2组为生长能力中等，活菌数时间分布不均匀的类型，包括了短乳杆菌FJAT-43776、发酵乳杆菌FJAT-13771；
第3类为生长能力较弱，活菌数时间分布不均匀类型，包括了嗜酸乳杆菌FJAT-13772、嗜热链球菌FJAT-43774。

乳酸菌是否适应植物性原料的发酵，不仅表现菌种差异上，同时表现在发酵行为上。不同的乳酸菌进入发酵周期的时间不同；
丁娟芳等[18]从传统酱菜中分离的乳酸肠球菌DGJ-17 (Enterococcuslactis) 最适生长温度为30℃，培养12 h后进入对数生长期,30 h后细胞生物量趋于稳定；
李小艳等[19]从泡菜中分离的植物乳杆菌3 m-1在30℃条件下2 h后进入对数期，22 h进入稳定期。不同发酵时间活菌数的分布特性不同，这些行为都是影响植物性原料乳酸菌发酵饮品加工的因素[20-24]。类似情形也出现在本研究中，不同乳酸菌在荔枝乳酸菌饮品培养基中生长周期差异显著，乳酸菌生长周期影响着荔枝乳酸菌饮品的发酵时间的选择。

本研究引入多样性指数(优势度指数、香农指数、均匀度指数)来描述发酵过程活菌数分布多样性指数；
优势度指数指示着发酵过程活菌数的集中程度，优势度指数越小，表明活菌数分布越集中；
香农指数反映着活菌数量及其在时间上的分布均匀度，当活菌数越高，在时间上分布越均匀，该指数越大；
均匀度指数反映了活菌数在时间上分布的均匀程度，每个时间上活菌数分布越相近，该指数越大。如鼠李糖乳杆菌FJAT-13807活菌数分布多样性指数(优势度指数=0.86、香农指数=2.00、均匀度指数=0.91)显著高于短乳杆菌FJAT-43776(优势度指数=0.07、香农指数=0.20、均匀度指数=0.09)，表明前者活菌数在发酵过程分布较为均匀，后者分布不均匀。活菌数分布多样性指数能敏感地区分出发酵过程活菌数分布的均匀性，相关的研究未见报道。

本研究为乳酸菌饮品发酵菌种筛选及其发酵行为提供了模式方法，通过发酵过程活菌数变化评估乳酸菌的发酵能力，引入活菌数分布多样性指数(优势度指数、香农指数、均匀度指数)揭示发酵过程乳酸菌时间分布的均匀性，通过聚类分析综合评判乳酸发酵行为与特性。对荔枝乳酸菌饮品发酵菌种筛选及其发酵行研究结果表明，鼠李糖乳杆菌FJAT-13807发酵能力强，发酵过程活菌数分布较均匀，1～6 h进入发酵适应期，12～30 h进入发酵对数期，36～48 h进入发酵稳定期，48 h以后进入发酵衰亡期，最适合应用于荔枝乳酸菌饮品发酵。

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