奶牛NR1D1基因的真核表达载体构建、表达谱及其在卵巢组织的定位

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王逸群，刘祖培，李雅婷,2，张海森,2，李 丹，靳亚平,2，陈华涛,2*

(1.西北农林科技大学动物医学院，杨凌 712100；
2.西北农林科技大学 农业农村部动物生物技术重点实验室，杨凌 712100)

地球的自转带来了光照、温度等外界环境因素的昼夜节律性变化，生物体为预测并适应这些外界环境因素的节律性变化，在漫长的进化过程中逐渐形成了一套内源性的自主调控系统，称为生物钟[1]。生物钟广泛存在于动物、植物、细菌以及真菌等地球上的大部分生命体中，是机体昼夜节律产生的分子基础[2-3]。哺乳动物生物钟是一个完整的层级控制系统，位于下丘脑视交叉上核(suprachiasmatic nucleus，SCN)的中枢生物钟接收并整合视网膜下丘脑束传递的周期性光线信号的明暗变化，通过神经与体液途径将时间信息传递至肝、肺、肌肉、卵巢与睾丸等组织器官，从而协调同步化大量的外周生物钟，共同维持机体生理稳态[4-6]。

在哺乳动物体内，几乎所有的细胞都存在自主维持的昼夜节律振荡器，即由多个生物钟基因及其编码蛋白相互作用构成的转录-翻译反馈环路[7]。核受体NR1D1是昼夜节律生物钟系统的重要组分，由于该蛋白缺乏对配体依赖性共激活因子募集和核受体转录激活至关重要的C端螺旋结构，因此主要表现出转录抑制作用[8-10]。近年来应用基因组学、生化以及药理学技术的众多研究证据表明，NR1D1在昼夜节律以及肝、胰腺、卵巢与睾丸等组织正常生理功能的稳态维持过程中发挥至关重要的作用[11-15]。

目前，对于哺乳动物生物钟系统的研究多以啮齿类动物为模型，关于反刍动物NR1D1基因生物学功能的研究则相对较少。在前期的研究中，人们发现环境因素(光照、温度等)与饲养方式(饲粮配比、限制性饲喂等)的改变能够通过反刍动物的生物钟系统影响其生产性能[16-21]。然而，目前人们对反刍动物生物钟系统分子基础的认识相对有限，深入探究反刍动物生物钟基因的生物学功能，或可为人们寻找提高反刍动物生产性能的新方法和新靶点提供思路。

基于前期研究基础，本试验旨在克隆奶牛NR1D1基因的蛋白编码序列(coding sequence，CDS)，构建该基因的真核表达载体，同时使用生物信息学软件对该基因编码蛋白的理化特性进行初步的预测和分析，并利用qPCR及免疫组织化学技术(IHC)检测NR1D1基因在奶牛不同组织的表达谱，以期为深入探究奶牛NR1D1基因的生物学功能提供前期基础和关键材料。

1.1 组织与细胞

5头成年(24月龄)健康雌性奶牛的心、肝、脾、肺、瘤胃、结肠、小肠、胰腺、肌肉及皮下脂肪、卵巢组织采自陕西省咸阳市某屠宰场，DH5α感受态细胞购自北京天根生化科技有限公司，HEK293T细胞由中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库提供。

1.2 主要试剂

Trizol、PrimeSTAR Max DNA Polymerase、QuickCutBamH Ⅰ均购自日本TaKaRa公司，FSQ-301反转录试剂盒购自日本TOYOBO公司，DNase/RNase-Free Water购自北京索莱宝科技有限公司，ClonExpress II One Step Cloning Kit、SYBR qPCR Master Mix均购自南京诺唯赞生物科技有限公司，无内毒素质粒小提中量试剂盒购自北京天根生化科技有限公司，Turbofect转染试剂购自美国Thermo Fisher公司，Anti-HA tag Antibody、Anti-NR1D1 Antibody均购自美国Abcam公司，多聚甲醛固定液购自武汉赛维尔生物科技有限公司，免疫组化超敏UltraSensitiveTMSP试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.3 引物设计与合成

根据NCBI数据库中的基因序列信息，在线设计可扩增奶牛NR1D1基因CDS区全长的PCR引物、可同时扩增奶牛与人NR1D1基因的实时荧光定量PCR(qPCR)引物；
并设计扩增人、奶牛GAPDH基因与奶牛RPLP0基因的qPCR内参引物，引物序列信息见表1(小写字母表示同源臂，下划线部分表示BamH Ⅰ的酶切位点)。引物均由西安擎科生物科技有限公司合成。

表1 引物信息Table 1 Primer sequences information

1.4 奶牛NR1D1基因真核表达载体构建及鉴定

1.4.1 PCR扩增奶牛NR1D1基因的CDS区 使用Trizol法提取奶牛肝组织的总RNA，按照逆转录试剂盒说明书合成cDNA。以cDNA为模板，使用带有同源臂的引物进行PCR反应，反应体系50 μL：2×PrimeSTAR Max Premix 25 μL，cDNA模板(50 ng·μL-1)4 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，ddH2O 19 μL。反应程序：98 ℃预变性30 s；
98 ℃变性10 s，63 ℃退火15 s，72 ℃延伸56 s，共35个循环；
72 ℃终延伸2 min。

1.4.2 同源重组法构建奶牛NR1D1基因真核表达载体 使用限制性内切酶BamH Ⅰ对pcDNA3.1-Puro-N-3HA载体进行单酶切使其线性化，按照ClonExpress Ⅱ试剂盒说明书配制同源重组反应体系，37 ℃反应30 min后立即置于冰上冷却。重组产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将菌液涂布至含羧苄青霉素的LB固体培养基37 ℃过夜培养后，挑取单克隆菌落接种至含有羧苄青霉素的LB液体培养基，37 ℃ 200 r·min-1摇床培养12 h后，使用无内毒素质粒小提中量试剂盒提取质粒。

1.4.3NR1D1基因真核表达载体的鉴定 使用限制性内切酶BamH Ⅰ对获得的重组质粒进行单酶切，同时使用空载体作为对照；
以重组质粒为模板，使用NR1D1基因CDS区扩增引物进行PCR反应。酶切及PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，将结果符合预期的样本送至西安擎科生物科技有限公司测序，比较插入片段序列与NCBI数据库中奶牛NR1D1基因序列是否一致。

1.5 奶牛NR1D1基因序列及其编码蛋白的生物信息学分析

在NCBI中查找不同物种NR1D1基因序列(表2)，结合测序结果，利用MegAlign软件分析各物种间NR1D1基因CDS区的同源性，并利用MEGA7软件构建系统进化树；
利用在线软件分析预测奶牛NR1D1蛋白性质及生物学功能，在线软件及网址见表3。

表2 各物种NR1D1基因CDS序列来源Table 2 The sources of NR1D1 gene’s CDS in each species

表3 所用生物信息学在线软件Table 3 Bioinformatics online softwares

1.6 检测奶牛NR1D1基因在HEK293T细胞的过表达

1.6.1 细胞培养与转染 复苏HEK293T细胞并传代，待细胞长满60 mm培养皿后，将其消化传代至两个6孔板中继续培养，细胞密度达到60%以上时，每个6孔板分别转染pcDNA3.1-3HA-cNR1D1重组质粒(过表达组)及pcDNA3.1-Puro-N-3HA空质粒(对照组)各3孔，培养24 h后，收取一个6孔板中的细胞样品，用于检测NR1D1基因在mRNA水平的过表达效果；
培养48 h后，收取另一6孔板中的细胞样品，用于检测NR1D1蛋白的过表达效果。

1.6.2 实时荧光定量PCR检测奶牛NR1D1基因在mRNA水平的表达 提取对照组和过表达组细胞的总RNA，反转录合成cDNA作为qPCR反应的模板。20 μL反应体系：2×ChemQ SYBR qPCR Master Mix 10 μL，cDNA模板(2.5 ng·μL-1)5 μL，上、下游引物各0.4 μL(10 μmol·L-1)，ddH2O 4.2 μL。反应程序：95 ℃预变性3 min；
95 ℃变性10 s，60 ℃退火与延伸30 s，40个循环；
熔解曲线95 ℃ 10 s；
65 ℃ 60 s，后以每秒0.2 ℃升温至97 ℃，采集熔解曲线荧光信号。

1.6.3 Western blotting检测奶牛NR1D1蛋白的表达水平 提取对照组和过表达组细胞的总蛋白，进行SDS-PAGE凝胶电泳，上样量为15 μg；
将35～100 ku区域的蛋白转印至硝酸纤维素(PVDF)膜，10%脱脂奶粉室温封闭2 h后洗膜(TBST溶液洗膜3次，每次10 min，下同)；
根据目的蛋白大小将PVDF膜剪开，分别置于一抗(兔抗HA多克隆抗体、兔抗NR1D1单克隆抗体、兔抗β-Actin单克隆抗体)中，4 ℃孵育过夜，洗膜；
将PVDF膜转移至二抗(HRP共扼羊抗兔抗体)，室温孵育1 h，洗膜；
将PVDF膜置于暗室，均匀滴加适量ECL发光液，进行曝光。

1.7 qPCR检测NR1D1基因在奶牛不同组织的表达谱

分别称取20 mg奶牛的不同组织，加入1 mL Trizol，使用组织匀浆器将其研磨至匀浆，Trizol法提取总RNA，反转录合成cDNA作为模板，以奶牛GAPDH、RPLP0基因为内参，qPCR检测奶牛NR1D1基因在不同组织的表达情况。qPCR反应体系与反应程序同“1.6.2”。

1.8 IHC检测NR1D1蛋白在奶牛卵巢组织的分布

将固定后的奶牛卵巢组织修整为2 cm×0.5 cm×2 cm左右的小块，注意保持较大黄体及卵泡结构的完整性。将修整后的组织块置于梯度乙醇溶液中脱水，脱水后置于二甲苯中透明，随后将组织浸蜡、包埋，制作石蜡切片。取奶牛卵巢组织石蜡切片，使用二甲苯将石蜡切片充分脱蜡，依次经梯度乙醇水化后，将石蜡切片放入柠檬酸抗原修复液中，使用微波炉高火加热至沸腾后，中火继续加热20 min，进行抗原修复，待完全冷却至室温后，PBS清洗(每次5 min，共计4次)，用油笔在组织周围3 mm处画圈。按照免疫组化超敏UltraSensitiveTMSP试剂盒说明书对抗原修复后的切片进行免疫组织化学染色，使用光学显微镜观察NR1D1在卵巢不同发育阶段卵泡中的表达分布情况并拍照保存[22]。

1.9 数据统计分析

采用2-ΔΔCt法将qPCR中的Ct值转化为基因相对表达量，利用GraphPad Prism 6分析定量数据。进行非配对t检验，比较对照组与过表达组HEK293T细胞中NR1D1 mRNA表达水平的差异性；
进行单因素方差分析，以比较奶牛不同组织中NR1D1 mRNA表达水平的差异性。P< 0.05表示差异显著，P< 0.01表示差异极显著，结果以“平均值±标准误”表示。

2.1 奶牛NR1D1基因CDS区全长序列的获取

对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，奶牛NR1D1基因CDS区PCR扩增产物在接近2 000 bp处有一清晰、明亮的条带，且条带大小与预期一致(奶牛NR1D1基因CDS区全长序列1 842 bp，同源臂42 bp)，说明成功获得奶牛NR1D1基因CDS区全长片段。

M. 5 000 bp DNA相对分子质量标准；
1.NR1D1基因CDS区全长的PCR扩增产物M. 5 000 bp DNA marker; 1. PCR amplification product of NR1D1 gene’s full-length CDS region图1 奶牛NR1D1基因CDS区全长PCR扩增产物的鉴定结果Fig.1 Identification results of the PCR amplification products of the cow NR1D1 gene’s full-length CDS region

2.2 奶牛NR1D1基因真核表达载体的构建

重组质粒单酶切及PCR鉴定产物琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示，重组质粒单酶切后，分别在预期的位置出现2个条带(5 211 bp和1 842 bp)，条带大小与空质粒单酶切条带及重组质粒PCR扩增产物条带大小一致。测序结果显示，重组质粒中插入片段序列与NCBI数据库中牛NR1D1基因CDS区序列完全一致，表明pcDNA3.1-3HA-cNR1D1重组质粒构建成功。

M. 10 000 bp DNA相对分子质量标准；
1.空质粒单酶切产物；
2.重组质粒单酶切产物；
3.重组质粒PCR扩增产物M. 10 000 bp DNA marker; 1. Single digestion product of empty plasmid; 2. Single digestion product of recombinant plasmid; 3. PCR amplification product of recombinant plasmid图2 奶牛NR1D1基因真核表达载体酶切及PCR鉴定Fig.2 Enzyme digestion and PCR identification of cow NR1D1 gene’s eukaryotic expression vector

2.3 奶牛NR1D1基因CDS区序列分析

对不同物种NR1D1基因CDS区进行同源性比对，结果如图3所示，NR1D1基因CDS区在反刍动物间高度保守，同源性在97%以上，且牛NR1D1基因CDS区与猪、马、大鼠、小鼠、人的同源性超过85%，说明哺乳动物NR1D1基因CDS区总体较为保守。根据同源性比对结果构建系统进化树，结果如图4所示，牛NR1D1基因CDS区与山羊、绵羊遗传距离最近，与斑马鱼的遗传距离最远。

图3 不同物种NR1D1基因CDS区同源性比对Fig.3 Homology comparison of NR1D1 gene’s CDS region in different species

图4 奶牛NR1D1基因CDS区系统进化树Fig.4 Phylogenetic tree of the cow NR1D1 gene’s CDS region

2.4 奶牛NR1D1蛋白理化性质与功能预测分析

2.4.1 奶牛NR1D1蛋白的基本理化性质 利用ProtParam预测奶牛NR1D1蛋白的基本理化性质，结果显示，NR1D1蛋白共包含613个氨基酸，分子量为67 ku，理论等电点为8.75。利用ProtScale预测NR1D1蛋白亲水性，结果如图5所示，NR1D1蛋白第212位氨基酸分值最低(-2.822)，表明该位点亲水性最强；
第541位氨基酸分值最高(2.633)，表明该位点疏水性最强。且NR1D1蛋白总平均亲水性(GRAVY)为-0.494，多数氨基酸表现出亲水性，说明奶牛NR1D1蛋白为亲水性蛋白。

图5 奶牛NR1D1蛋白亲水性预测Fig.5 Hydrophilic prediction of cow NR1D1 protein

2.4.2 奶牛NR1D1蛋白跨膜结构及亚细胞定位分析 应用DeepTMHMM对奶牛NR1D1蛋白跨膜结构进行预测，结果如图6A所示，奶牛NR1D1蛋白为胞内蛋白，不含跨膜区。应用DeepLoc-1.0预测奶牛NR1D1蛋白的亚细胞定位，结果如图6B显示，奶牛NR1D1蛋白定位于细胞核中，其核定位序列位于第200位氨基酸附近。

A. NR1D1蛋白跨膜结构预测；
B. NR1D1蛋白核定位序列预测A. Prediction of NR1D1’s transmembrane structure; B. Prediction of NR1D1’s nuclear localization sequence图6 奶牛NR1D1蛋白跨膜结构及核定位序列分析Fig.6 Transmembrane structure and nuclear localization sequence analysis of cow NR1D1

2.4.3 奶牛NR1D1蛋白磷酸化位点预测 应用NetPhos-3.1软件预测奶牛NR1D1蛋白磷酸化位点，结果如图7所示，奶牛NR1D1蛋白共存在86个潜在的磷酸化位点，其中包含63个丝氨酸位点、18个苏氨酸位点以及5个酪氨酸位点。

图中红色表示丝氨酸位点；
绿色表示苏氨酸位点；
蓝色表示酪氨酸位点；
紫色表示阈值In this figure, red stands for serine; green stands for threonine; blue stands for tyrosine; purple stands for threshold图7 奶牛NR1D1蛋白磷酸化位点预测Fig.7 Prediction of phosphorylation sites of cow NR1D1 protein

2.4.4 奶牛NR1D1蛋白结构预测 利用SOPMA预测奶牛NR1D1蛋白的二级结构，结果如图8A所示，奶牛NR1D1蛋白二级结构主要由无规则卷曲、α-螺旋、延伸链、β-转角组成，占比依次为55.30%、25.77%、13.05%和5.87%。利用SWISS-MODEL对奶牛NR1D1蛋白三级结构进行预测，并用PyMOL软件比较奶牛、山羊、小鼠NR1D1蛋白三级结构的相似性，结果如图8B所示，奶牛与山羊NR1D1蛋白间的原子均方根差(RMSD)为1.576，奶牛与小鼠NR1D1蛋白间RMSD为1.933，说明奶牛NR1D1蛋白三级结构与山羊、小鼠较为相似。

A. 奶牛NR1D1蛋白二级结构预测，图中蓝色表示α-螺旋，红色表示延伸链，绿色表示β-转角，紫色表示无规则卷曲；
B. 奶牛(a)、山羊(b)、小鼠(c)NR1D1蛋白三级结构预测，图中蓝色表示α-螺旋，红色表示β-折叠，紫色表示无规则卷曲A. Prediction of the secondary structure of cow NR1D1 protein, blue represents α-helix, red represents extended strand, green represents β-turn, and purple represents random coil; B. Predicted tertiary structure of NR1D1 protein in cow (a), goat (b) and mouse (c), blue represents α-helix, red represents β-sheet, and purple represents random coil图8 奶牛NR1D1蛋白三级结构预测及比较Fig.8 Prediction and comparison of the tertiary structure of cow NR1D1 protein

2.4.5 奶牛NR1D1蛋白互作与功能分析 使用STRING对奶牛NR1D1蛋白互作进行预测分析，结果如图9所示，与NR1D1发生互作的前10位蛋白包括芳香烃受体核转位因子样蛋白(aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like protein 1，ARNTL)、时钟昼夜节律调节蛋白(circadian locomotor output cycles kaput protein，CLOCK)、隐花色素昼夜节律调节蛋白2(cryptochrome circadian clock 2，CRY2)、神经元PAS结构域蛋白2(neuronal PAS domain protein 2，NPAS2)、基本螺旋-环-螺旋家族成员e41(basic helix-loop-helix family member e41，BHLHE41)、热休克转录因子2(heat shock transcription factor 2，HSF2)、磷脂酶C-β2(phospholipase C-β2，PLCB2)、核受体辅抑制因子1(nuclear receptor co-repressor 1，NCOR1)、含金属β内酰胺酶结构域蛋白1(metallo-β-lactamase domain-containing protein 1，MBLAC1)与RAS激活剂样蛋白3(RAS protein activator-like 3，RASAL3)。功能预测分析结果显示，NR1D1能够直接抑制核心生物钟组分ARNTL(BMAL1)、CLOCK和CRY2的表达，负反馈调节昼夜节律生物钟系统；
此外，其还与脂质和胆汁酸代谢、脂肪生成、糖异生和巨噬细胞炎症反应等生理过程密切相关；
在细胞层面，NR1D1可能参与氧化还原状态应答、类固醇激素受体及糖皮质激素受体信号通路的负反馈调节等过程。

图9 奶牛NR1D1蛋白互作预测Fig.9 Prediction of cow NR1D1 protein’s interaction

2.5 奶牛NR1D1基因在HEK293T细胞中的过表达

重组质粒转染HEK293T细胞后，奶牛NR1D1基因在mRNA和蛋白水平的过表达效果如图10所示，与对照组相比，重组质粒转染组奶牛NR1D1 mRNA表达水平升高约2 000倍(P< 0.01)；
应用HA及NR1D1抗体进行Western blotting检测，结果显示重组质粒转染组的奶牛NR1D1蛋白相对于对照组有显著的过表达。

A. pcDNA3.1-3HA-cNR1D1转染后mRNA相对表达量，**P<0.01表示差异极显著；
B. pcDNA3.1-3HA-cNR1D1转染后NR1D1蛋白的表达，M表示蛋白分子量标准；
CON. 空质粒转染对照组；
OVE. 重组质粒转染组A. Relative mRNA expression after transfecting pcDNA3.1-3HA-cNR1D1, **P<0.01 indicates a very significant difference; B. Expression level of NR1D1 protein after transfecting pcDNA3.1-3HA-cNR1D1, M denotes protein molecular weight standard; CON. Control group transfected empty plasmid; OVE. Test group transfected recombinant plasmid图10 奶牛NR1D1基因在HEK293T细胞的过表达Fig.10 Overexpression of cow NR1D1 gene in HEK293T cells

2.6 NR1D1基因在奶牛不同组织的表达谱

如图11所示，NR1D1基因在奶牛不同组织中的mRNA表达丰度存在显著性差异(P<0.05),奶牛NR1D1基因在瘤胃、结肠与肝中表达量较高，在小肠、胰腺、皮下脂肪与肌肉中表达量较低。

图中不同字母表示差异显著(P<0.05)In each set of bars, different letters mean significant difference (P<0.05)图11 奶牛NR1D1基因mRNA在不同组织的表达丰度Fig.11 Expression abundance of cow NR1D1 gene’s mRNA in different tissues

2.7 NR1D1蛋白在奶牛卵巢组织的表达分布

如图12所示，NR1D1表达于不同发育时期卵泡的颗粒细胞中，且该蛋白主要表达分布于细胞核内。

A.初级卵泡(400×，NR1D1抗体)；
B.次级卵泡(200×，NR1D1抗体)；
C.卵丘-卵母细胞(200×，NR1D1抗体)；
D.颗粒细胞(200×，NR1D1抗体)；
E.卵丘-卵母细胞(200×，阴性对照)；
F.颗粒细胞(200×，阴性对照)A. Primary follicle (400×, Anti-NR1D1); B. Secondary follicle (200×, Anti-NR1D1); C. Cumulus-oocyte (200×, Anti-NR1D1); D. Granulosa cells (200×, Anti-NR1D1); E. Cumulus-oocyte (200×, negative control); F. Granulosa cells (200×, negative control)图12 NR1D1在奶牛卵巢组织的表达分布Fig.12 The distribution of NR1D1 in dairy cow’s ovary

近年来在啮齿类动物中的研究发现，NR1D1不仅是哺乳动物生物钟系统的重要组分，同时也参与调控生殖、代谢与免疫等多个重要生理过程，但奶牛NR1D1基因的功能还未被深入研究。本课题组前期已成功构建了多个山羊生物钟基因的真核表达载体，并以此为材料探究了生物钟基因BMAL1对山羊睾丸间质细胞睾酮合成的调控作用[23-25]。BMAL1基因在山羊睾丸间质细胞过表达后，上调类固醇激素合成关键基因StAR和HSD17B3在mRNA及蛋白水平的表达，睾酮合成增加。此外，本课题组利用pcDNA3.1-gRORα载体在HEK293T细胞中进行了双荧光素酶报告试验，检测到山羊RORα蛋白显著上调了山羊BMAL1和NR1D1基因启动子的转录活性，探究了该蛋白的生物学功能[26-27]。上述证据说明，以pcDNA3.1为骨架构建的真核表达载体是一个可靠的载体工具，可帮助研究者们深入探究反刍动物生物钟系统相关基因在生殖与代谢等生理过程中的功能与作用机制。

NR1D1作为一种重要的核受体，主要通过结合靶基因启动子区域的顺式作用元件RORE抑制其转录，是哺乳动物生物钟补充反馈环路中重要的负调控因子，同时也参与调控糖脂代谢、炎症与免疫、繁殖等过程中关键基因的表达[8, 13, 28-30]。本研究利用多种生物信息学软件预测分析了奶牛NR1D1基因及其编码蛋白的理化性质和生物学特性，结果显示NR1D1基因在哺乳动物间同源性较高，说明该基因在进化过程中相对保守；
而牛、山羊及小鼠NR1D1蛋白的三级结构较为相似，提示NR1D1蛋白功能可能在反刍动物与小鼠之间存在相似之处。因此，有关小鼠NR1D1基因的研究结果或可为探究奶牛NR1D1基因功能提供一定的参考。

蛋白质相互作用预测结果表明，与NR1D1发生互作的前10位蛋白中，除ARNTL(BMAL1)、CLOCK、CRY2等昼夜节律生物钟蛋白外，还包括转录抑制因子NCOR1，以及PLCB2、RASAL3等一些参与细胞信号转导且与免疫过程相关的调控因子[31-32]。其中，HSF2在哺乳动物精子发生中发挥重要作用，其缺失导致睾丸体积缩小、精子数目减少并损害雄性动物生殖能力[33]；
此外，一项近期的研究发现，HSF2能够缓解肠道炎症，在结肠炎中发挥保护作用[34]。以上结果表明，NR1D1可能在奶牛生物钟系统以及免疫、糖脂代谢与生殖等众多生理过程中发挥特定的作用，但这些仅为初步预测分析结果，尚需进一步的验证。

因此，在功能预测分析的基础上，本研究利用qPCR技术检测了NR1D1基因在奶牛不同组织的表达分布。此前，Dai等[35]检测到生物钟基因NR1D1在雄性天祝白牦牛下丘脑-垂体-性腺轴(HPG轴)的不同组织中均有表达分布，且IHC结果显示，NR1D1主要表达于牦牛睾丸组织各种生精细胞以及合成类固醇激素的睾丸间质细胞中。上述研究重点关注的是NR1D1在雄性牦牛生殖过程中的功能，而本研究检测到NR1D1基因在奶牛多个组织中均有表达，其mRNA在瘤胃中的表达丰度极显著高于其他组织，其次是结肠与肝，推测该基因可能参与奶牛体内营养物质的消化吸收以及能量代谢等过程。瘤胃是反刍动物特有的消化器官之一，也是其营养物质消化分解的主要部位[36]。Gao等[37]通过体外试验研究发现，山羊瘤胃上皮细胞增殖和短链脂肪酸转运蛋白的mRNA丰度与生物钟蛋白PER2有关，提示生物钟可能参与瘤胃中某些生物学过程的调控。那么，作为生物钟系统重要组分的NR1D1在其中发挥了何种功能，值得进一步探究。

卵巢颗粒细胞主要分泌雌二醇(E2)，是参与哺乳动物类固醇激素合成与分泌的重要细胞类群，它能够为卵母细胞提供营养物质和能量，对卵母细胞的发育、成熟以及正常功能的维持具有重要意义[38]。已有证据表明，NR1D1在大鼠卵巢中能够调节类固醇激素合成和雌性生殖能力[39-40]。本研究采用IHC染色的方法，检测发现NR1D1主要分布在卵巢颗粒细胞中。类似地，Wang等[41]通过IHC及免疫荧光染色发现，NR1D1在猪卵巢颗粒细胞中高表达，且主要分布在细胞核中，进一步研究发现，体外培养的猪卵巢颗粒细胞中NR1D1与类固醇合成关键基因CYP19A1、CYP11A1和StAR的表达呈现节律性。因此，推测在奶牛卵巢中，NR1D1基因可能同样参与调控类固醇激素合成、卵泡发育等过程，但其具体作用以及调控机制还需进一步的试验验证。

本研究成功构建了奶牛NR1D1基因真核表达载体，并实现了奶牛NR1D1基因在HEK293T细胞的高效表达。对奶牛NR1D1基因及其编码蛋白进行了生物信息学分析，并获得了该基因的组织表达谱，该基因在奶牛多个组织中均有分布，但表达水平存在显著差异，在瘤胃、结肠与肝中的表达量显著高于其他组织。在奶牛卵巢组织中，NR1D1的表达具有细胞类型的特异性，主要分布在不同发育阶段卵泡的颗粒细胞中。本研究结果为深入探究奶牛NR1D1基因的生物学功能提供了前期基础与关键材料。

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