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    叶黄素酯和叶黄素在蛋鸡体内的消化沉积及其对蛋黄颜色的影响

    时间：2023-04-08 12:20:04 来源：东东创业网 本文已影响人 东东创业网手机站

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    (1.河北植物提取创新中心有限公司，邯郸 057250；
    2.河北省植物源动物保健品技术创新中心，邯郸 057250；
    3.河北省植物资源综合利用重点实验室，邯郸 057250)

    叶黄素是一种含氧类胡萝卜素，多项研究表明叶黄素沉积在视网膜黄斑，可以吸收蓝光并通过淬灭氧自由基来保护视网膜免受光诱导的氧化损伤[1-2]。而作为饲料添加剂，叶黄素能沉积在鸡蛋、肉鸡和水产动物的皮肤中，满足消费者对畜禽产品色泽的偏好[3-4]。同时，与果蔬和补充剂等食物来源相比，通过生物体蓄积的叶黄素也有更好的生物利用度[5-6]。

    天然叶黄素的主要工业来源是提取和皂化万寿菊中的叶黄素酯获得叶黄素单体。惠伯棣等[7]在大鼠上的研究认为动物可以直接利用叶黄素酯，但其生物利用度仅相当于叶黄素单体的18.55%。相反，黄小春等[8]研究表明，蛋鸡对叶黄素酯和叶黄素的利用效率没有显著差异。本研究拟通过比较叶黄素酯和叶黄素在蛋鸡体内的消化和沉积情况，以及对蛋黄颜色的影响，探讨叶黄素酯作为蛋鸡饲料添加剂的可行性。

    1.1 试验材料

    叶黄素和叶黄素酯为万寿菊提取，类胡萝卜素含量均为2%；
    叶黄素标准品(X6250)、玉米黄质标准品(14681)均为Sigma-Aldrich公司产品。

    1.2 试验设计

    选取350日龄、健康的海兰灰蛋鸡72只，随机分成2个组，每组6个重复，每个重复6只鸡。试验期共56 d，划分为2个阶段。阶段1为28 d的耗竭期，期间饲喂粉状小麦型基础饲粮(表1)，其营养水平配制标准参照《海兰灰商品蛋鸡饲养管理手册》。阶段2为28 d的正试期，期间2个组分别饲喂在小麦型基础饲粮中添加40 mg/kg叶黄素和叶黄素酯的试验饲粮。饲粮取样后冻存于-80 ℃待测。试验期间的环境参数和日常管理参照《海兰灰商品蛋鸡饲养管理手册》执行。

    表1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) %

    在阶段1结束时，每个组随机挑选6只蛋鸡进行翅静脉采血并分离血清，之后屠宰取肝脏和卵巢样品，另以重复为单位收集当日的鸡蛋，使用鸡蛋品质测定仪(以色列奥卡EA-01)对蛋黄颜色评分后将蛋黄匀浆均匀。在阶段2的最后4 d，每日记录产蛋数，对蛋黄颜色评分，并以重复为单位连续收集蛋黄和部分粪便及时冻存于-80 ℃。阶段2结束时，每个重复随机挑选1只蛋鸡采集血清、肝脏和卵巢样品。

    1.3 检测指标

    饲粮、粪便、血清、肝脏、卵巢和蛋黄中的类胡萝卜素含量使用高效液相色谱(HPLC)仪测定，仪器型号为沃特世E2695，使用Ultimate硅胶柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)，流动相为正己烷∶乙酸乙酯∶异丙醇(730∶270∶15)，流速设置为1.4 mL/min，运行时间20 min，柱温40 ℃，紫外检测器波长设置为474 nm。样品中的类胡萝卜素含量以叶黄素标准品做单点定量法计算。

    饲粮和粪便样品的前处理参考GB/T 23187—2008《饲料中叶黄素的测定 高效液相色谱法》，但样品不进行皂化，即：称取2 g左右的饲粮或10 g左右的粪便置于具塞三角瓶中，加入30 mL的萃取剂(正己烷:丙酮∶无水乙醇∶甲苯=34∶23∶20∶23)超声萃取10 min后，再加入30 mL正己烷和50 mL的10%无水硫酸钠溶液，剧烈振荡1 min后离心(4 000 r/min，5 min)，然后抽取上清液经0.22 μm滤膜过滤后上样检测。

    血清样品的前处理参考黄旸木等[9]的方法略作修改，即：移取0.5 mL血清至2 mL离心管中，加入0.5 mL的无水乙醇(含0.01%抗坏血酸)，涡旋1 min后再加入0.7 mL的正己烷，继续涡旋2 min后3 000 r/min离心7 min，吸取上清液过0.22 μm滤膜后上样检测。

    肝脏、卵巢和蛋黄样品前处理参考GB 5009.248—2016《食品安全国家标准 食品中叶黄素的测定》略作修改，即：肝脏、卵巢或蛋黄样品匀浆后，称取5 g左右至50 mL离心管中，加入20 mL混合溶剂(正己烷∶甲醇∶乙酸乙酯=1∶1∶1)，2 500 r/min下涡旋20 min，再加入10 mL正己烷和10 mL的10%无水硫酸钠溶液，剧烈振荡后4 000 r/min离心5 min，抽取上清液过滤上样。

    叶黄素和叶黄素酯的表观消化率测定采用内源指示剂法，以饲粮和粪便中的盐酸不溶灰分作为内源指示剂，其测定方法按GB/T 23742—2009《饲料中盐酸不溶灰分的测定》执行。

    一是实施意识领先方略，强化水安全意识。充分重视水在社会经济中的重要基础地位，提高水作为资源要素、环境要素、生态要素、安全要素的基本认识，统筹谋划水资源开发利用与社会经济发展。进一步落实领导责任，尤其是地方政府责任，把水安全责任落实作为干部政绩考核、选拔任用的重要依据。建立健全节水社会动员参与机制，充分利用各类媒体，全面客观介绍水资源危机、节水常识，保护水文化遗产，提高公众节水意识。高度重视和发挥非政府组织在水安全中的积极作用，营造企业履行社会责任的社会环境。

    饲粮中叶黄素或叶黄素酯沉积到蛋黄中的效率参考Karadas等[10]的方法计算，计算公式为：

    叶黄素或叶黄素酯沉积效率(%)=鸡蛋中的类胡萝卜素(A)总量/饲粮中的类胡萝卜素(B)总量。

    式中：A=蛋黄重(g)×[试验组蛋黄中类胡萝卜素含量(mg/kg)-耗竭期蛋黄中类胡萝卜素含量(mg/kg)]；
    B=采食量(g)×饲粮中类胡萝卜素含量×产蛋率(%)。

    1.4 数据统计分析

    试验数据用平均值±标准差表示，采用SPSS 21.0软件进行统计分析，使用独立样本t检验进行显著性分析，使用回归-线性进行相关性分析和方程拟合，以P<0.05为差异显著标准。

    2.1 饲粮和粪便中类胡萝卜素含量及表观消化率

    叶黄素和玉米黄质标准品在本试验色谱条件下的保留时间分别为10.26和11.39 min；
    万寿菊来源叶黄素酯的酯基为多种脂肪酸，无标准品，其保留时间需根据叶黄素酯样品皂化前后色谱峰的变化情况确定，在本试验的色谱条件下其保留时间为2.33 min。

    图1和图2分别展示了饲粮和粪便中类胡萝卜素的出峰情况。从图中可见，饲粮中保留时间2.33 min的为叶黄素酯，10.26 min的为叶黄素，11.39 min的为玉米黄质；
    粪便中还有保留时间3.39 min的物质；
    与叶黄素酯组饲粮不同，该组粪便中叶黄素酯和叶黄素都可检出。表2列出了饲粮和粪便中类胡萝卜素含量。由表中数据可知，小麦型基础饲粮和耗竭期蛋鸡粪便中类胡萝卜素含量很低。添加叶黄素或叶黄素酯饲粮的类胡萝卜素含量检测结果与理论添加量(40 mg/kg)较一致。

    图1 饲粮中类胡萝卜素色谱图Fig.1 Chromatogram of carotenoids in diet

    图2 粪便中类胡萝卜素色谱图Fig.2 Chromatogram of carotenoids in excrement

    表2显示，叶黄素和叶黄素酯的表观消化率分别为81.76%和84.80%，但差异不显著(P>0.05)。

    2.2 肝脏中类胡萝卜素含量

    图3展示了肝脏中类胡萝卜素的种类。从图中可见，3个肝脏样品中类胡萝卜素种类一致。肝脏中类胡萝卜素主要以叶黄素酯的形式存在，除叶黄素酯、叶黄素和玉米黄质外，在3～5 min还有物质出峰，可能是类胡萝卜素经肝脏代谢后的产物。由表2中数据可知，正试期内叶黄素组和叶黄素酯组蛋鸡肝脏中类胡萝卜素含量远高于耗竭期，但2组间没有显著差异(P>0.05)。

    图3 肝脏中类胡萝卜素色谱图Fig.3 Chromatogram of carotenoids in liver

    表2 不同样品中类胡萝卜素含量以及蛋黄色泽评分、类胡萝卜素表观消化率和沉积效率测定结果Table 2 Determination results of different samples for carotenoids content,yolk color score,apparent digestibility and deposition efficiency of carotenoids

    2.3 血清、卵巢和蛋黄中类胡萝卜素含量

    图4 血清中类胡萝卜素色谱图Fig.4 Chromatogram of carotenoids in serum

    图5 卵巢中类胡萝卜素色谱图Fig.5 Chromatogram of carotenoids in ovarium

    图6 蛋黄中类胡萝卜素色谱图Fig.6 Chromatogram of carotenoids in yolk

    由表2中数据可知，饲喂添加叶黄素或叶黄素酯饲粮28 d后，其血清、卵巢和蛋黄中类胡萝卜素含量比耗竭期明显提高；
    正试期内，叶黄素组和叶黄素酯组之间血清中类胡萝卜素含量没有显著差异(P>0.05)，但卵巢和蛋黄中类胡萝卜素含量则表现为叶黄素酯组显著高于叶黄素组(P<0.05)。叶黄素组和叶黄素酯组类胡萝卜素沉积到蛋黄中的效率分别是11.27%和16.70%，2组间差异显著(P<0.05)。蛋黄中类胡萝卜素含量(X)和蛋黄色泽评分(Y)的相关系数(R2)为0.912，拟合线性方程为Y=0.182X+1.343(P<0.05)。

    3.1 叶黄素酯在蛋鸡体内的消化

    一般认为，叶黄素酯会在消化道脂肪酶的作用下水解成叶黄素单体和脂肪酸而被吸收，但叶黄素酯与叶黄素单体的吸收效率孰高还存在争议。惠伯棣等[7]的研究认为，大鼠对叶黄素酯的生物利用度是叶黄素单体的18.55%。Hencken[11]评估叶黄素酯在肉仔鸡的吸收效率为叶黄素单体的40%～60%。但是在蛋鸡上的一些研究显示，不论是从利用率还是蛋黄色泽，都表明蛋鸡对叶黄素酯的吸收效率更高，至少是与叶黄素单体没有明显差异[8,12]。在本研究中，叶黄素酯组蛋鸡的类胡萝卜素表观消化率及血清中类胡萝卜素含量与叶黄素组相比均没有显著差异。由此可见，动物对叶黄素酯的利用率与动物种类和动物生长阶段有关，成年家禽可以充分消化吸收叶黄素酯。

    3.2 叶黄素在蛋鸡组织里的沉积

    饲料中的叶黄素或叶黄素酯在体内的吸收可分为4个阶段，即从食物中被消化释放、与脂类形成水溶性胶束、被小肠上皮细胞吸收、通过淋巴系统运输至血液。但因家禽的淋巴系统不发达，包含类胡萝卜素的乳糜微粒可能直接进入肠系膜静脉汇至门静脉运送至肝脏，微粒粒径太大不会通过肝区毛细血管直接沉积，而由血液循环至其他组织[13-16]，在人上的研究显示运输载体是高密度脂蛋白和低密度脂蛋白[17]，而在禽上则可能是极低密度脂蛋白[18]。Breithaupt等[12]总结认为，叶黄素在血液中以单体形式运输，但在沉积部位会被该组织的酶重新酯化。对产蛋家禽而言，卵巢不合成脂类物质[16]，故蛋鸡血清、卵巢和蛋黄中的类胡萝卜素种类一致，以叶黄素单体形式为主。相反，肝脏是体内主要的叶黄素及其代谢物的储存器官[17,19]。对产蛋家禽而言，肝脏的脂肪合成最为活跃[20]。本研究也证实，蛋鸡肝脏中叶黄素酯为优势形式。此外，本研究还发现，蛋鸡肝脏的类胡萝卜素HPLC图谱比饲粮类胡萝卜素HPLC图谱在3～5 min多3个出峰物质，推测应是叶黄素的代谢产物。叶黄素在体内可发生C-3和C-3’氧化形成酮式类胡萝卜素，按氧化程度和异构划分主要有3种，即：3-羟基-β,ε-3’酮基类胡萝卜素、3-羟基-ε,ε-3’酮基类胡萝卜素、ε,ε-3,3’二酮基类胡萝卜素[19]。

    3.3 叶黄素或叶黄素酯对蛋黄色泽的影响

    蛋鸡饲喂不添加色素的麦类饲粮的情况中，其蛋黄颜色罗氏色度为3～4。添加12 mg/kg的叶黄素后，蛋黄颜色评分在第5天即达到稳定状态[21]。同样的添加剂量在鹌鹑中，蛋黄颜色评分达到稳定需要7 d，而蛋黄中的类胡萝卜素含量达到稳定状态则需要11 d[22]。在本研究中，蛋黄的采样时间为正试期的第28天，其颜色评分和类胡萝卜素含量都处于稳定状态。此时，蛋黄颜色评分与蛋黄中类胡萝卜素含量呈线性相关，意味着饲粮中添加的叶黄素或叶黄素酯在蛋黄中的沉积效率将决定着蛋黄色泽。

    同时比较叶黄素和叶黄素酯在蛋鸡中沉积效率的定量研究尚缺乏。有研究表明，添加12 mg/kg的叶黄素可使蛋黄中类胡萝卜素含量分别达到37.87和39.01 mg/kg，其沉积效率分别为38%和36%[10,21]。在本研究中，添加40 mg/kg的叶黄素其蛋黄中类胡萝卜素含量为26.35 mg/kg，沉积效率只有11.27%。Islam等[22]研究表明，饲喂添加40 mg/kg叶黄素酯的小麦型饲粮的蛋鸡，蛋黄中总类胡萝卜素含量为18.01 mg/kg。而本研究中相同添加剂量的叶黄素酯则使蛋黄中类胡萝卜素含量达到了38.72 mg/kg。叶黄素或叶黄素酯的沉积效率受色素原料、使用剂量、试验动物品种、日龄、饲粮配方等的影响[10,22]，使不同研究的结果可比性较差。

    本研究发现，在相同条件下，叶黄素酯在蛋鸡上的表观消化率和在蛋黄中的沉积效率都高于叶黄素，从而使蛋黄色泽评分更高，提示这2种不同加工工艺的叶黄素产品存在吸收利用上的差异。相较于叶黄素单体，叶黄素酯没有经过皂化工艺，保留了脂肪酸、磷脂等成分。而这些成分使叶黄素形成的胶束更容易被吸收[23]。此外，皂化还会造成叶黄素产品中天然维生素E含量的损失。维生素E有促进肠道吸收叶黄素的作用[22]，其原因可能是叶黄素易被氧化，而这种氧化可以被其他抗氧化物质缓解，如添加100 IU/kg的维生素E可提高蛋黄色泽和叶黄素转化率[24]。

    ① 叶黄素在蛋鸡血液、卵巢和蛋黄中主要以单体的形式存在，而在肝脏中则主要以酯的形式存在。

    ② 叶黄素酯可以被蛋鸡充分利用，且应用效果不差于叶黄素单体。

    ③ 蛋黄中类胡萝卜素含量与蛋黄颜色评分有显著的线性关系。

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