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    守宫和制水蛭两种动物类中药的质量标准

    时间：2023-01-07 09:45:06 来源：东东创业网 本文已影响人 东东创业网手机站

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    滨州医学院药学院 山东 烟台 264003

    被称为“血肉有情之品”的动物类中药，在我国已有悠久的应用历史，并在中国医药宝库中有着举足轻重的地位。与植物药相比，动物药成分更为复杂，由于动物药活性强、潜力大、疗效高、应用范围广等优点，其需求量不断增加，进而导致大量混伪品充斥中药材市场，严重的影响了临床疗效及其制剂的质量[1-2]。因此，规范动物药治疗评价，对中药材市场具有重要的意义。

    目前，守宫和制水蛭多收载于各省市中药材标准和饮片炮制规范中，但仅限于来源、性状和炮制方法等简单内容。例如，1979年版《江西中药炮制规范》仅规定了守宫的基原和炮制方法，2012年版《福建省中药饮片炮制规范》则只在规定了基原、炮制方法和性状鉴别检查，质量水平仍然偏低。在1986年版《北京市中药炮制规范》中仅规定了制水蛭的性状鉴别，2008年版新增了其基原、浸出物、炮制方法鉴别，质量水平有待提高。为保证守宫和制水蛭的饮片质量水平，亟需对其质量控制方法进行研究。本研究分别收集了来自全国不同产区的6批守宫和10批制水蛭样品，从性状、显微特征、薄层鉴别、水分、灰分、酸不溶性灰分和醇浸出物含量等方面进行研究，为进一步完善提升守宫和制水蛭的质量标准提供依据。

    1.1 材料

    1.1.1 仪器与试剂 马弗炉(上海YAMATO科技贸易有限公司F0510C)；
    电热鼓风干燥箱(上海一恒科学有限公司DHG-9140A)；
    恒温水浴锅(常州德科仪器制造有限公司HH-6)；
    超声波清洗机(上海比郎仪器制造有限公司BILON22-500C)；
    显微镜(北京科至达信息技术有限公司CX31RBSFA)；
    守宫对照药材(批号为121734-201601，河北安国药材市场)；
    水蛭对照药材(批号为121061-201806，安徽亳州仁中药业)；
    硅胶G薄层板(烟台市化学工业研究所、青岛海洋化工厂、美国merck公司)；
    所用试剂均为分析纯。

    1.1.2 实验材料 守宫购自河北安国药材市场，药材来源见表1，经滨州医学院药学院代龙教授鉴定为壁虎科动物无蹼壁虎GekkoswinhoanaGüenlhe、多疣壁虎Gekkojaponicus(DumeriletBibron)或蹼趾壁虎GekkosublimatesGüenlhe的干燥全体。水蛭药材购自河北弘森药业有限公司和安徽亳州仁中药业，其来源见表1，经滨州医学院药学院代龙教授鉴定为水蛭科动物蚂蟥WhumaniapigraWhitman、水蛭HirudonpponicaWhitman或柳叶蚂螨WhimaniaacranulataWhitman干燥全体的炮制品。

    1.2 方法

    1.2.1 性状鉴别 采用《中国药典》2020年版(四部)通则0212项下的鉴定方法，对守宫和制水蛭的形状、大小、表面(色泽与特征)、质地、断面(折断面或切断面)及气味等特征进行观察并描述。

    1.2.2 显微鉴别 分别将各批次守宫粉末和制水蛭粉末过四号筛，挑取少许置载玻片上，滴加10%水合氯醛试液进行透化，加盖玻片，置于生物显微镜下观察。

    1.2.3 薄层色谱鉴别 守宫参照《中国药典》2020年版四部通则研究[3]，采用70%乙醇5 mL、50%乙醇5 mL、70%甲醇5 mL和50%甲醇5 mL做样方法，使用不同型号厂家薄层板(青岛海洋HSG板、烟台江友HSH板和HSG板)和展开剂(正丁醇-冰醋酸-水(3∶1∶1)，正丁醇-冰醋酸-水(6∶1∶1))以及不同点样量(3、2、1 μL)进行考察，最终所确定的薄层鉴别方法如下所示：取守宫粉末0.4 g置于锥形瓶中，加70%乙醇5 mL，超声提取30 min，过滤，滤液作为供试品溶液。另取壁虎对照药材0.4 g，同法制成对照药材溶液。分别吸取上述溶液各3 μL，点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水(3∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，用上述展开剂进行二次展开，取出，晾干，喷以茚三酮试液，在105℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视。

    制水蛭参照《中国药典》2020年版一部水蛭项下的鉴别方法[4]，本研究分别选取青岛海洋、烟台江友和默克的G系列预制薄层板作为点样材料；
    采用环己烷-乙酸乙酯(4∶1)、正己烷-乙酸乙酯(4∶1)、正己烷-乙酸乙酯-水(8∶2∶1)作为展开剂，分别点样1、3、5和10 μL对制水蛭各批次饮片和水蛭对照药材的样品溶液进行薄层试验进行考察。最终确定了以下最佳鉴别方法：取制水蛭粉末1 g置于锥形瓶中，加乙醇5 mL，超声处理15 min，过滤，取滤液作为供试品溶液。另取水蛭对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。分别吸取上述两种溶液各5 μL，点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯(4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，分别置日光及紫外光(365 nm)下检视。

    1.2.4 浸出物、总灰分、酸不溶性灰分和水分含量的测定 浸出物、总灰分、酸不溶性灰分和水分含量测定分别参照《中国药典》2020版(四部)通则下的醇溶性浸出物测定法、总灰分测定法、酸不溶性灰分测定法、水分含量测定法(烘干法)进行测定。

    2.1 性状鉴别 守宫呈扁平条状，全长10～12 cm，头椭圆形而扁，有眼一对，头体背面灰黑色或灰色，覆以粒鳞，胸腹面黄白色，被覆瓦状鳞，尾基与体等长，指、趾间无蹼迹或有蹼迹。气味微腥。制水蛭呈不规则段状、扁块状或扁圆柱状，略鼓起，背部黑褐色，腹面棕黄色至棕褐。质地酥脆，气微腥，微香。

    2.2 鉴别

    2.2.1 显微鉴别 守宫粉末棕黄色或棕褐色；
    可见的特征性显微结构主要有鳞片、横纹肌、骨碎片、皮肤碎片等(图1)。鳞片近无色，单个鳞片较大，呈多角形、类圆形。有的布有细小粒状物，多与皮肤碎片叠在一起。横纹肌纤维较多，近无色或淡黄色，有细密横纹，明暗相间，呈平行的波峰状。骨碎片较多，无色或淡黄色，呈不规则形状，表面有细小裂缝状或针状孔隙，骨陷窝呈裂缝状、长条状或类长圆形，多为同方向排列。皮肤碎片呈淡黄色或棕褐色，表面观细胞界限不明显，布有棕色或棕黑色色素，聚集成星芒状。制水蛭粉末为深褐色或深棕色；
    可见表皮细胞、纤维细胞、纵肌纤维细胞等特征性显微结构(图2)。表皮细胞呈类圆形或五边形，色泽近黄色或无色，排列紧密，纹理清晰，不甚透明。纤维细胞的纤维长短不一，成束或单个存在，透明。纵肌纤维细胞断面清晰，细胞内部中空，外层增厚，可见增厚纹理。

    A.鳞片；
    B.横纹肌；
    C.骨碎片；
    D.皮肤碎片。

    A.表皮细胞；
    B.纤维细胞；
    C.纵肌纤维细胞。

    2.2.2 薄层色谱鉴别 于日光灯下进行检试，与守宫对照药材比较，所收集的6批次守宫的薄层色谱中斑点清晰，且分离效果良好(图3)。分别在日光及紫外光(365 nm)下检试，所收集的制水蛭的供试品与对照药材在相应的位置上显示相同颜色的斑点(图4)。

    1为对照药材，2～7分别对应样品1～6供试药材。

    Z-6 为水蛭对照药材，Z-1～Z-5分别对应样品Z-1～Z-5供试药材，Z-7～Z-8分别对应样品Z-6～Z-10供试药材

    2.3 浸出物、总灰分、酸不溶性灰分、水分含量的测定 依照“1.2.3”法，测定6批守宫粉末样品和10批制水蛭药材粉末样品的浸出物、总灰分、酸不溶性灰分、水分以及醇浸出物含量的测定结果(表1)。

    表1 守宫和制水蛭水分、总灰分和酸不溶性灰分测定结果(n=3)

    结果显示：6批守宫和10批制水蛭的平均含水量分别为8.87%、8.94%，总灰分平均含量分别为16.96%、4.84%，酸不溶性灰分平均含量分别为0.39%、0.89%，醇浸出物平均含量分别为19.27%、25.03%。

    依据上述结果，参照《中国药典》2020年版，暂规定守宫水分不得超过10.0%，总灰分不得超过20.0%，酸不溶性灰分不得超过0.5%，醇溶性浸出物不得少于14.0%；
    制水蛭水分不得超过16.0%，总灰分不得超过7%，酸不溶性灰分不得超过1.5%，醇溶性浸出物不得低于15%。

    中药壁虎又称守宫，为壁虎科动物无蹼壁虎Gekko swinhoana Güenlhe等的干燥全体。早在宋朝赵佶所著《圣济总录》中就有关于守宫入药的记载。《本草纲目》中记载守宫味咸、寒，有小毒，具有祛风定惊、散结解毒的功效，可用于治疗中风瘫痪、手足不举、历节风痛、风痰惊痫、瘵疡恶疮、小儿疳痢和血积瘰等疾病。现代研究表明，壁虎具有抗肿瘤、平喘、抗血栓形成和改善组织血液供应等作用[5-7]。水蛭为水蛭科动物蚂蟥Whumania pigra Whitman、水蛭Hirudo npponica Whitman或柳叶蚂螨Whimania acranulata Whitman的干燥全体，气味咸、苦，有小毒，具有破血通经、逐瘀消瘕之功[6]，主要用于用于治疗血瘀经闭、癥瘕痞块、中风偏瘫和跌扑损伤。由于水蛭特殊的腥臭味，多将其炮制入药，制水蛭作为水蛭的炮制品[7]，已广泛应用于临床多种疾病，特别是在心脑血管疾病、慢性肾脏疾病和糖尿病等疾病的治疗方面极具开发潜力[10-13]。

    由于部分动物类药材价格较高，资源紧缺，目前动物类中药常发生掺伪等情况。因此，本研究对来源于全国不同地区的守宫和制水蛭分别进行性状鉴别、薄层鉴别、水分、总灰分、酸不溶性灰分和浸出物含量测定考察，并初步制定出了它们的相关限度。通过本研究，一方面可为守宫和制水蛭的饮片生产、市场流通及其产品开发提供检验检测依据，另一方面有助于为进一步的守宫和制水蛭的药用活性成分和药理作用研究提供依据。

    本研究发现，守宫可见的特征性显微结构主要有鳞片、横纹肌、骨碎片和皮肤碎片等；
    制水蛭则可见表皮细胞、纤维细胞、纵肌纤维细胞等。采用显微鉴别对守宫和制水蛭进行粉末显微鉴别，可在一定程度上弥补性状鉴别的不足。薄层色谱研究表明，6批守宫和10批水蛭分别与守宫对照药材和水蛭对照药材具有相同的斑点，且分离度较好。通过研究所建立的薄层鉴别、水分、总灰分、酸不溶性灰分和浸出物含量测定作简单，准确可靠，可用于守宫和制水蛭的质量控制。

    本研究的局限在于未进行守宫和制水蛭中特征性相关成分的含量研究。其主要原因是动物类中药研究水平普遍偏低，大多缺乏明确的且与药效相关联的指标性成分。另一方面，尽管中国药典2020年版针对水蛭活性蛋白建立了基于生物活性测定法，但本研究所涉及的制水蛭是水蛭药材的烫制品，在炮制过程中蛋白质会发生变性反应，同时距离水蛭炮制的工艺标准化尚有一大段距离，导致基于生物活性测定法对制水蛭进行质量控制不合理。此外，由于所用批次较少，所拟定标准代表性不强。因此，在后续的实验中我们将会继续累积数据进一步完善该标准。

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