海洋红酵母不同添加剂量对凡纳滨对虾生长、免疫酶活性及抗病力的影响

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(1.中国海洋大学 海水养殖教育部重点实验室，山东 青岛 266003；
2.青岛海洋科学与技术国家试点实验室，山东 青岛 266235；
3.青岛瑞滋海珍品发展有限公司，山东 青岛 266408)

凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)生长速度快，适应环境能力强，是世界对虾养殖产量最高的品种[1]。但近几年来，愈来愈多的致病微生物也导致对虾养殖成功率下降[2]。此外，在养殖过程中抗生素药物的不科学使用，还造成了不同程度的环境和食品安全问题(如耐药细菌的出现、水生生态系统的破坏和肠道共生菌群的改变)[3]。针对这些问题，人们对在水产养殖中益生菌的使用日益关注，多种微生物及其细胞组分和代谢产物已被作为益生菌或免疫刺激剂研究并应用，用以提高对虾的非特异性免疫和抗氧化能力，从而增强它们对病原体的抵抗力[4]。益生菌可能在疾病控制中发挥重要作用，并已被证明在某些情况下是抗菌化合物的优质替代品[5-7]。

海洋红酵母(Rhodotorulamucilaginosa)属于单细胞真核生物，从自然海洋环境中分离而来。菌落形态呈圆形或椭圆形，肉眼可见红色，无性繁殖，多极出芽，经检测无酒精发酵能力[8-9]。它含有丰富的蛋白质，同时也含多种营养物质，如以虾青素为主的类胡萝卜素、维生素、碳水化合物、各种消化酶及不饱和脂肪酸等[10]。海洋红酵母不仅可以促进水生动物生长、提高成活率、改善动物体色，还可以显著提高养殖动物机体的抗氧化能力和非特异性免疫能力[11]。它是一类抗逆性较强、有较好的耐盐性的腐生菌，是优质的虾青素生产菌，在动物饲料添加剂方面也极具潜力[12]。在水产养殖中，目前海洋红酵母主要是作为饵料使用，用于育苗、养殖过程中的营养强化，也可作为饲料添加剂，起到促进发育生长、提高生长率、预防疾病等作用[13-15]。然而，从目前的研究和应用现状态看，关于海洋红酵母在水产动物饲料中适宜的添加量尚缺乏一致的数据。

以凡纳滨对虾为研究对象，研究了不同浓度的海洋红酵母添加量对凡纳滨对虾的生长性能、免疫酶活性及对副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)病原胁迫的影响，以期为海洋红酵母在凡纳滨对虾饲料中的适宜添加浓度提供理论基础。

1.1 实验材料

本试验所使用的海洋红酵母菌株(菌株编号：RM)来自于中国海洋大学水产养殖生态学实验室保种中心，将菌种进行液体发酵后制成干粉制剂，菌体含量为9.17×1010cfu/g。

凡纳滨对虾购于青岛卓越海洋集团有限公司对虾养殖场，初始体重为7.23±0.24 g。

超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、溶菌酶(LSM)试剂盒、酸性磷酸酶(ACP)试剂盒、碱性磷酸酶(AKP)试剂盒、总一氧化氮合酶(TNOS)试剂盒均采购于南京建成生物工程研究所，测定过程参照试剂盒说明书进行操作。

病原胁迫实验所用副溶血弧菌由中国水产科学院黄海水产研究所提供。

1.2 饲料制备

基础饲料选用广东粤海有限公司的南美白对虾配合饲料(2号料)，其主要饲料成分见表1。

表1 基础饲料主要成分

本研究共设置了4个处理组和1个对照组。其中，海洋红酵母的不同添加浓度分别为1.0×108、1.0×109、1.0×1010和1.0×1011cfu/kg饲料(分别记为T1、T2、T3和T4)。按实验设计的添加量，将菌粉与凡纳滨对虾配合饲料均匀混合，再在其表面包裹一层褐藻酸钠(3.15 g/500 g)和鱼油(4.2 ml/500 g)。之后揉搓阴干，在4 ℃冰箱中保存以备后用[16]。对照饲料由凡纳滨对虾配合饲料表面直接包裹一层褐藻酸钠和鱼油制成(比例同上，记为DZ)。

1.3 养殖管理

养殖用水盐度为23。幼虾运回后，在水族箱中先驯化暂养5 d。暂养期间，养殖用水的盐度逐日升高2，直至30，稳定2 d再开始养殖实验。实验过程中，凡纳滨对虾幼虾养殖于30×40×50 cm的水族箱中，每个水族箱养殖10尾虾，每个处理组分别设置5个平行。在整个驯化暂养过程中使用南美白对虾配合饲料(2号料)，每天两次投喂(10:00 am和17:00 pm)，保证每天投喂总量为对虾体重4%～5%。

驯化暂养结束后饥饿24 h。选择活力旺盛、规格相近的对虾250尾，随机分为5组，每个组别设置5个平行(10尾虾/平行)，置于50 L的玻璃水族箱中养殖，养殖周期为42 d。实验期间，每天投喂两次(8:00 am和17:00 pm)，日投喂量为对虾体重的4%～5%之间。分别收集残饵和粪便，于60 ℃下烘干保存。每天换水1次，换水量为总体积的1/3～2/3。

实验期间环境条件：pH为8.0±0.1，盐度保持在30，水温25 ℃左右，连续微量充气，保持溶氧在5 mg/L以上。每日察看并记录对虾死亡和摄食状况，如有死虾，及时清除。

1.4 样品采集与处理

1.4.1 凡纳滨对虾生长指标测定

养殖试验结束后，停止投喂，禁食24 h，对各处理组对虾进行分别计数和称重，参照王苓等[16]的计算方法计算对虾成活率、特定生长率(SGR)、饲料效率(FER)、消化率(ADR)等生长指标。

1.5 对虾免疫酶活性测定

1.5.1 样品预处理

养殖结束后，每个处理选取30尾对虾抽取血液，用无菌注射器从凡纳滨对虾腹部血窦中抽取血淋巴置于1.5 mL加厚离心管中，置于4 ℃冰箱中1夜后离心(3 000 r/min，10 min)，取上层血清保存于-80 ℃冰箱中。

1.5.2 免疫酶活性测定

稀释样品至适宜浓度，然后参照试剂盒说明书测定超氧化物歧化酶(SOD)、溶菌酶(LSM)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、总一氧化氮合酶(TNOS)。

1.6 病原攻毒实验

将保存的菌株活化后接种于TSB肉汤培养基中，28 ℃震荡培养24 h制成菌悬液以备后用。经预实验，副溶血弧菌的适宜注射浓度确定为5×107cfu/mL。养殖实验结束后，保持养殖条件不变，将取样后剩余的对虾正常饲喂3 d后进行副溶血弧菌攻毒试验。其中，每个处理分别设置3个平行，每个平行5尾虾，利用无菌注射器将35 μL副溶血弧菌注射入凡纳滨对虾体内，对照组注射相同体积的生理盐水。

整个攻毒试验持续15 d，期间养殖条件不变。每天察看并记录对虾的活动、摄食及死亡状况，如有死虾，及时清除。

1.7 数据统计分析

数据采用SPSS Statistics 19软件进行单因素方差分析和Duncan’s多重比较进行差异显著性检验，以P<0.05为差异显著水平，统计结果用平均值±标准误(Mean±S.E.)表示。

2.1 不同浓度海洋红酵母对凡纳滨对虾生长性能的影响

由表2可知，添加海洋红酵母对凡纳滨对虾生长具有不同程度的促进作用。除T1组外，各试验处理组的末体重均显著高于对照组(P<0.05)。其中，T2和T3组(添加量为1.0×109和1.0×1010cfu/kg)对虾特定生长率显著高于对照组(添加量为1.0×1010cfu/kg)，但两组之间差异不显著(P>0.05)。不同处理对虾存活率未见显著差异，均在90.0～94.0%之间(P>0.05)。

表2 添加不同浓度海洋红酵母对凡纳滨对虾生长性能的影响

与对照组相比，添加不同浓度的海洋红酵母均显著提高了凡纳滨对虾的消化率(P<0.05)，但各处理组间差异性不显著(P>0.05)。T2和T3组的饲料效率均显著高于对照组及其他两个处理组(P<0.05)。

2.2 添加不同浓度海洋红酵母对凡纳滨对虾免疫酶活性的影响

2.2.1 不同浓度海洋红酵母对对虾血清超氧化物歧化酶活性的影响

由图1可知，添加不同浓度的海洋红酵母后，各处理组的SOD活性均显著高于对照组(P<0.05)，其中，T2和T3处理组显著高于T1和T4组(P<0.05)。

图1 不同浓度海洋红酵母对凡纳滨对虾血清超氧化物歧化酶活性的影响

2.2.2 添加不同浓度海洋红酵母对凡纳滨对虾酸性磷酸酶活性的影响

由图2可知，添加不同剂量的海洋红酵母均可以提高凡纳滨对虾血清酸性磷酸酶(ACP)活性。各处理组的ACP活性均显著高于对照组(P<0.05)，其中，T3组(添加量为1.0×1010cfu/kg)活性最高，显著高于其他各组(P<0.05)。T2组活性显著高于T1、T4组(P<0.05)，但T1和T4组之间差异不显著(P>0.05)。

图2 添加不同浓度海洋红酵母对凡纳滨对虾血清酸性磷酸酶活性的影响

2.2.3 不同浓度海洋红酵母对凡纳滨对虾碱性磷酸酶活性的影响

由图3可知，饲料中添加不同剂量的海洋红酵母后，凡纳滨对虾的血清碱性磷酸酶(AKP)活性表现出差异性。其中，T2和T3处理组AKP活性均显著高于对照组(P<0.05)，以T3组(添加量为1.0×1010cfu/kg)的活性最高，显著高于T2组(P<0.05)。但T1和T4组AKP活性与对照组相比差异不显著(P>0.05)。

图3 添加不同浓度海洋红酵母对凡纳滨对虾血清碱性磷酸酶活性的影响

2.2.4 不同浓度海洋红酵母对凡纳滨对虾溶菌酶活性的影响

由图4可知，添加不同浓度的海洋红酵母对凡纳滨对虾血清溶菌酶(LSM)活性影响有所不同。其中，T2和T3处理组的LSM活性均显著高于对照组(P<0.05)，以T3组(添加量为1.0×1010cfu/kg)的活性最高，显著高于T2组(P<0.05)。但T1和T4组LSM活性与对照组相比差异不显著(P>0.05)。

图4 添加不同浓度海洋红酵母对凡纳滨对虾血清溶菌酶活性的影响

2.2.5 添加不同浓度海洋红酵母对凡纳滨对虾总一氧化氮合酶活性的影响

由图5可知，饲料中添加不同剂量的海洋红酵母后，各处理组的血清总一氧化氮合酶(TNOS)活性均有所提高。其中，T2、T3和T4组的TNOS活性均显著高于对照组(P<0.05)，T2组虽活性最高，但与其他两组相比差异并不显著(P>0.05)。T1组与对照组差异不显著性(P>0.05)。

图5 添加不同浓度海洋红酵母对凡纳滨对虾血清总一氧化氮合酶活性的影响

2.3 副溶血弧菌攻毒

注射副溶血弧菌后，被感染的对虾表现为摄食量下降、附肢发红、空胃、肝胰腺肿大、不好动或沿养殖桶壁漫游，活力弱，直至最后死亡。

图6显示了注射副溶血弧菌后各处理组对虾的累积死亡率情况。从图中可看出，各处理组对虾在攻毒后陆续出现死亡，持续不同时间之后又逐渐停止死亡。其中，各处理组对虾在攻毒后第5—6天逐渐停止死亡，而对照组对虾则在第8天停止死亡。

图6 注射副溶血弧菌后各处理组凡纳滨对虾的累计死亡率

整个攻毒实验期间，各处理组对虾累计死亡率分别为53%、27%、20%和33%，均显著低于对照组(73%)(P<0.05)。各处理组间比较，以添加海洋红酵母的1.0×1010cfu/kg处理组对虾累积死亡率为最低。

3.1 饲料中添加海洋红酵母对凡纳滨对虾生长的影响

海洋红酵母遍及于海洋环境中，是海水正常微生物区系的一部分[17]。研究表明，海洋红酵母既可提高水产动物的存活率，又可改善养殖效果，还可增强水产动物免疫力、减少抗生素使用，因此被广泛应用于鱼、虾、蟹、贝、海参等水产动物的饲料中[18]。Scholz等研究显示，在凡纳滨对虾幼虾饵料中定量添加海洋红酵母能使其成活率大大提高，并在促进生长的同时，还增强了幼虾对环境因子的耐受力[19]。齐琼的研究也表明，凡纳滨对虾摄食添加过海洋红酵母的饵料后，其增重率、特定生长率、饵料系数、肝体比等指标得到有效改善[20]。而本研究中，在饲料中添加不同浓度的海洋红酵母均显著提高了凡纳滨对虾的末体重，其中，添加浓度为1.0×109和1.0×1010cfu/kg处理组凡纳滨对虾的特定生长率及饲料效率显著提高，优于其添加浓度。这一结果表明，添加适宜剂量的海洋红酵母可以明显改善凡纳滨对虾的生长性能。

益生菌是一种对宿主生长、健康有益的活的微生物，在水产养殖领域得到广泛应用[21]。研究认为，益生菌可以分泌胞外消化酶如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等，提高养殖动物对营养物质消化吸收的效率，而且也可以产生氨基酸、小分子多肽和各种维生素等营养性物质，因而促进了养殖动物的生长[22-24]。作为一种重要的益生菌，海洋红酵母可以合成虾青素、β-胡萝卜素和VE，并且其产生的消化酶类和生长因子能够有效地促进水产动物消化吸收营养素，提高水产动物的生长速率和饲料利用率[15]。杨铿等的研究发现，饲料中添加2‰和4g/‰的海洋红酵母能显著降低尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)的饲料系数，同时可增加罗非鱼蛋白酶、淀粉酶及脂肪酶活性，提高其生长性能[25]。而在杨世平等[20]的研究中，饲料中加入沼泽生海洋红酵母(R.paludigenum)，显著提高了凡纳滨对虾肝胰腺中蛋白酶和脂肪酶活性，减少了其肠道中弧菌数量、降低了弧菌和总细菌的比例，使对虾的肠道微生物菌群结构得到改善，从而促进对虾的生长。另外，张坤等[26]将胶红酵母以添加量分别为109、1010和1011cfu/kg添加到刺参饵料中后发现，三种添加浓度均能显著提高刺参的生长性能，其中以1010cfu/kg添加量的效果最好。这与本研究中获得凡纳滨对虾最佳生长性能的海洋红酵母添加浓度(109-10cfu/kg)稍有差异。因此，在实际应用中应根据不同养殖对象的不同情况适当调整海洋红酵母的添加量。

3.2 饲料中添加海洋红酵母对凡纳滨对虾免疫酶活性及抗病力的影响

凡纳滨对虾免疫系统属于先天免疫，其机体保护及疾病防御主要依靠非特异性免疫来完成。研究表明，超氧化物歧化酶(SOD)、溶菌酶(LSM)、碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)和一氧化氮合酶(TNOS)等的活性反映了对虾的免疫能力的高低，在凡纳滨对虾的免疫防御中起着重要的作用[27-28]。此外，SOD可以清除对虾体内多余的自由基、防御机体衰老和防止生物分子损伤[29]；
LSM在最前沿防御机制中起着重要的作用，可以水解革兰氏阳性菌的细胞壁，使细胞破裂死亡[30]；
ACP参与磷酸基团转移和代谢活动，提高物质的摄取和转运速度，与其他酶类构成吞噬细胞杀菌的物质基础，破坏和消除侵入体内的异物[31-32]。与此同时，ACP参与甲壳动物的解毒体系，并与甲壳动物在海水中磷质与钙质的吸取活动、磷酸钙的生成过程、甲壳素的形成和分泌密切相关[31-32]。对虾的机体受到免疫刺激时，免疫反应会激活体内的一氧化氮合酶，诱导激发释放出大量的NO，NO可参与一系列的免疫反应，对病原生物产生杀灭作用[33]。

海洋红酵母中富含以虾青素为主的类胡萝卜素，可通过消除自由基维护细胞膜的稳定性，因此具有增强宿主免疫力和抗氧化能力的功能。Subramanian等[34]研究发现，以从红树林中分离出的海洋红酵母作为免疫刺激源，添加10%酵母生物量养殖对虾15 d，然后用致病性霍乱弧菌(V.cholerae)攻毒，检测对虾血细胞数量、酚氧化酶活性等指标，结果显示海洋红酵母对对虾类具有较高的免疫刺激作用，显著提高对虾对致病性弧菌的抵抗力。齐琼的研究表明，添加0.025%～0.5%的2号红酵母可有效提高凡纳滨对虾ACP、LSM和过氧化氢酶活性；
投喂海洋红酵母饲料40 d后进行哈维氏弧菌(V.harveyi)攻毒试验，对虾死亡率显著降低[20]。从本研究结果看，饲料中添加不同浓度的海洋红酵母对上述5种非特异性免疫酶活性所产生的影响有一定差异。其中，添加浓度为1.0×1010cfu/kg处理组对虾血清中ACP、AKP和LSM活性显著高于对照组及其他各处理组，而1.0×109cfu/kg添加水平下，血清SOD和TNOS活性显著高于其他各组。从副溶血弧菌攻毒的结果来看，虽然1.0×109和1.0×1010cfu/kg两个处理组均展现出了较强的抗病力，但以1.0×1010cfu/kg处理组的累计死亡率为最低，对病原的抵抗效果最好。因此，综合来看，1.0×1010cfu/kg的海洋红酵母添加量在提高对虾血清非免疫性能和抗病能力方面的效果最佳。

3.3 海洋红酵母的适宜添加浓度

李正[35]等比较了嗜酸乳杆菌(Lactobacilluscasei)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)、纳豆芽孢杆菌(Bacillusnatto)和黏红酵母(R.glutinis)等益生菌对牙鲆(Paralichthys)的益生作用，发现黏红酵母对牙鲆肠黏液的黏附能力最佳，在肠道内含物中可达103～104cfu/g，且显著降低了牙鲆因鳗弧菌(V.anguillarum)引起的死亡率。张坤[27]等研究表明，刺参摄入胶红酵母后可以在一定程度上提高其生长性能、免疫能力及抗病力，其中以107cfu/g添加量效果最好。夏冬梅[36]等发现，海洋红酵母添加量在一定范围内时，具备凡纳滨对虾的免疫增强剂功能；
但超出适宜范围后可能会出现过度免疫，造成对虾免疫过激和饲料浪费。王苓等[17]在凡纳滨对虾饲料中添加芽孢杆菌以提高对虾生长及非特异性免疫能力，结果表明当添加浓度为1.0×109cfu/kg时，其效果最佳。在本研究中，随着海洋红酵母添加浓度的增加，对虾的生长和免疫指标变化规律与上述研究结论基本上一致，以1.0×109和1.0×1010cfu/kg的添加量效果较好。若综合考虑对虾生长、非特异性免疫能力及对副溶血弧菌的抗病力，则以1.0×1010cfu/kg饲料为最适宜的添加浓度。

研究了添加不同浓度的海洋红酵母对凡纳滨对虾生长性能、免疫酶活性及对副溶血弧菌抵抗力的影响，结果表明添加1.0×109和1.0×1010cfu/kg海洋红酵母，对对虾生长、饲料效率、免疫酶活性及抗病力均具有显著提高作用。若综合考虑对虾生长、非特异性免疫能力及对副溶血弧菌的抗病力，则以1.0×1010cfu/kg饲料为最适宜的添加浓度。

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