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    饲粮中NFC与NDF比例影响肉牛肌肉氨基酸和蛋白质代谢

    时间：2023-02-16 08:25:05 来源：东东创业网 本文已影响人 东东创业网手机站

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    朱晋佳，吴祎程，吕小康，周传社

    (中国科学院 亚热带农业生态研究所 亚热带农业生态过程重点实验室，湖南 长沙 410125)

    近年来，为了提高反刍动物的生产性能和动物生产的经济效益，对反刍动物进行了高谷物饲粮的饲喂[1]。适宜的精粗比能够提高营养物质的消化率，最终提高生产性能。改变饲粮精粗比其本质上是改变了饲粮的非纤维碳水化合物(NFC)/中性洗涤纤维(NDF)比例。NFC主要包括淀粉、糖、果胶、果聚糖和有机酸等，是反刍动物的主要能量物质；
    NDF是粗饲料的主要组成成分[2]。因此饲粮结构的变化是反刍动物生产中的关键营养调控手段[3]。据报道，提高饲粮NFC/NDF比例能够提高反刍动物的生产性能，这也是生产中通常采用的做法。犊牛在饲喂NFC/NDF为1.35的全混合饲粮时，相比于饲喂NFC/NDF为0.80的饲粮不仅可以提高犊牛生长性能[4]，还可以使肉犊牛保持较高的平均日增重[5]。朱昊鹏等[6]研究发现，提高荷斯坦奶牛饲粮中NFC/NDF的比值，可以显著提高奶牛的生长性能。董利锋等[7]研究也进一步证实了饲粮中高NFC/NDF可以显著提高反刍动物干物质消化率、日增重等生长性能。生长性能的提高与肌肉的生长密切相关，肌肉中蛋白质和能量代谢是影响肌肉生长的主要原因[8]。但是，NFC/NDF比例对肉牛肌肉蛋白质和氨基酸代谢的潜在机制仍然未知，需要进一步探究。肉用动物的肉品质是决定养殖利润的关键所在，氨基酸作为主要的风味物质决定了肉的风味，饲粮是影响肉质的一个重要因素，改变饲粮中营养物质的含量或者组成的变化，皆可引起肉品质风味的变化[9]。因此，本试验选择生长期肉牛作为试验动物，探究不同NFC/NDF比例饲粮对肉牛肌肉氨基酸和蛋白质代谢的影响。本研究获得了动物保护委员会的批准，所有涉及的动物程序都按照中国科学院亚热带农业生态研究所机构的动物保护指南进行。

    1.1 试验设计采用单因素完全随机区组试验设计。28头体质健康、体质量(255±16.3)kg的安本杂牛×湘西黄牛随机分为2个处理组，每组14头。其中，对照组饲喂NFC/NDF为1.11的低精料全混合饲粮(total mixed ration,TMR)，试验组饲喂NFC/NDF为4.05的高精料全混合饲粮(TMR)。试验总周期为100 d，其中预饲期15 d，正试期85 d。100 d后进行屠宰，屠宰前24 h禁食。

    1.2 饲粮和动物管理试验肉牛饲粮按照肉牛营养标准进行配制(NRC,2000)。肉牛饲粮为全混合饲粮，肉牛试验饲粮组成成分及营养水平见表1。整个试验期间每天饲喂2次，分别在每日上午7：00和下午17：00喂食，全天自由饮水，定期打扫畜舍和清洁水槽，按照正常的免疫程序对试验牛进行驱虫、免疫。

    表1 饲粮原料成分及营养水平(干物质基础) %

    1.3 样品采集与处理正式试验结束后，肉牛禁食24 h，禁水12 h后屠宰。屠宰后立即分离背最长肌，用PBS冲洗干净，用剪刀剪成1 cm×1 cm小块，装在采样袋中，置于-80℃液氮中保存，用于后续样品分析。

    1.4 样品分析

    1.4.1背最长肌RNA的提取及cDNA的合成 使用RNAiso Plus(TaKaRa，大连，9108/9109)从背最长肌中提取总RNA，使用DNaseⅠ(Thermo Scientific,Waltham,MA,USA)去除基因组DNA。提取后使用NanoDrop 2000(Thermo Scientific,Waltham,USA)测定肌肉中总RNA纯度和浓度。使用Evo M-MLV RT试剂盒(AG11706，中国长沙)，在20 μL的体系中将1 μg总RNA反转录为cDNA,最后将cDNA存放于-20℃备用。

    1.4.2目的基因mRNA表达量的测定 利用SYBR Premix Ex TaqⅡ TaKaRa，大连，中国)在ABI-7900HT qPCR系统(美国应用生物系统公司,美国福斯特城)上进行qPCR测定，选择β-actin作为内参基因。所有引物均由上海生工合成(Sangon Biotech,中国上海)。目的基因引物序列及参数信息见表2。根据2-△△Ct方法计算mRNA的相对表达量。

    表2 引物序列及参数信息

    1.4.3背最长肌氨基酸含量测定 将肌肉样品冷冻干燥，称取干燥过的肉样0.8 g，放入离心管中，用盐酸匀浆，超声浸提30 min，摇匀后过滤。取2 mL过滤后的滤液于离心管中，加入2 mL 8%磺基水杨酸混匀，静置15 min，转速10 000 r/min离心10 min。取下层液体，孔径0.22 μm滤膜过滤后，采用日立L-8800全自动氨基酸分析仪测定肌肉中氨基酸的含量。

    1.4.4Western blot技术检测背最长肌蛋白表达量 液氮冻存牛肌肉样本解冻，转至2 mL EP管中，加入RIPA裂解液，置于冰上裂解10 min，收集裂解液，4℃、12 000 r/min离心10 min；
    取上清液用BCA蛋白定量试剂盒(KGP903，南京凯基生物公司)测定蛋白浓度。

    (1)取待测蛋白样品(肌肉组织裂解液)2 μL用去离子水补足20 μL，加入200 μL BCA工作液，混匀后37℃放置30 min，然后以0号孔为对照，测定样品562 nm波长处的D值；
    根据所测样品的D值，在标准曲线上即可查得样品的蛋白含量(μg)。计算蛋白质量浓度：以标准曲线上查得的相应蛋白含量(μg)除以样品稀释总体积体积(20 μL)，乘以样品稀释倍数即为待测样品的实际质量浓度(g/L)。

    (2)蛋白变性。各试验组取50 μL，按4∶1比例加入5×Loding buffer，混匀后热循环仪95℃15 min，-80℃保存。

    (3)电泳。往烧杯中依次加入去离子水、30%丙烯酰胺(Acrylamide)、1.5 mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)(PH 8.8)、10%十二烷基磺酸钠(SDS)充分混匀，再加入10%过硫酸铵(AP)和浓缩胶(TEMED)后立即摇匀，并用1 mL的移液枪加入到两层玻璃板之间，然后在胶上加一层去离子水液封，37℃放置30 min，再按上述方法配制5%的积层胶，室温放置30～60 min；
    待到积层胶凝固后将其拔出。将其放入电泳槽中根据所测蛋白浓度上样。接通电源，稳定电压100 V，15 min，当溴酚兰染料到分离胶以后将电压调至180 V继续电泳，到达凝胶底部时终止电泳。

    (4)转膜。按照分离胶的尺寸剪1张PVDF膜(美国Hybond公司)和6张滤纸，将膜与切好的带有目的条带的分离胶一起放入转膜液中平衡10 min，同时准备两块海绵；
    用转膜液将6张滤纸浸湿，按照海绵、滤纸(3张)、膜、凝胶、滤纸(3张)、海绵的顺序叠放好；
    将凝胶面与负极相连，PVDF膜与正极相连，接通电源，200 mA转膜1～2 h。

    (5)封闭。将PVDF膜放入用TBST Buffer稀释的5% BS摇2 h；
    用TBST将PVDF膜洗3次，每次5 min。

    (6)孵育抗体。一抗孵育：将PVDF膜放入一抗中(一抗浓度：RP36KB1 1∶500，P-RP36KB1 1∶250；
    FOXO3A 1∶500，P-FOXO3A 1∶500，elF4EBP1 1∶500，P-elF4EBP1 1∶250，mTOR 1∶1 000，P-mTOR 1∶1 000，β-actin 1∶10 000)，摇床上轻摇，4℃孵育过夜；
    用TBST将PVDF膜洗3次，每次5 min；
    二抗孵育：将PVDF膜放入二抗(稀释浓度：1∶5 000)中，摇床上轻摇，室温孵育2～3 h；
    用TBST将PVDF膜洗3次，每次10 min。

    (7)显影。将PVDF膜平铺到保鲜膜上，将ECL发光液(BL520A，美国Thermo公司)的A、B两种试剂等体积混合后，均匀的滴加到膜上，反应1 min后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入化学发光凝胶成像仪的暗室中，根据信号的强弱适当调整曝光时间，曝光。

    1.5 数据处理Western blot条带先采用Gel-Pro Analyzer 4 分析灰度值，然后所有的试验数据经Excel 2019进行初步整理，用SPSS 19.0统计软件进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)，Duncan法进行多重比较，设置统计差异显著水平为P<0.05。

    2.1 不同NFC/NDF饲粮对肉牛肌肉氨基酸组成的影响由表3可知，从肉牛肌肉中共检测出17种氨基酸。天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸和组氨酸在HCD组中的含量均显著高于LCD组(P<0.05)。HCD组中总氨基酸的含量比LCD组高出15.38%(P<0.05)。其余5种氨基酸2组之间均无显著差异(P>0.05)。

    表3 不同NFC/NDF饲粮对肉牛肌肉氨基酸组成的影响

    2.2 不同NFC/NDF饲粮对肌肉蛋白质合成基因mRNA表达量以及蛋白表达水平的影响由表4可知，与LCD组相比，HCD组肉牛肌肉IGF-1、S6K1、BCKDHA、BCAT、FOXO1和SLC38A2 mRNA表达水平显著上调(P<0.05)。与LCD组相比，HCD组肉牛肌肉FOXO3 mRNA表达水平显著下调(P<0.01)。由图1可知，HCD组p-mTOR、p-4EBP1、p-FOXO3A和S6K1蛋白表达量显著高于LCD组(P<0.01)，2组间mTOR、4EBP1和p-S6K1的蛋白表达水平无显著性差异(P>0.05)，但HCD组FOXO3A蛋白表达量显著低于LCD组(P<0.01)。

    表4 不同NFC/NDF饲粮对肉牛肌肉蛋白质合成基因mRNA表达量的影响

    图1 不同NFC/NDF饲粮对蛋白和磷酸化蛋白表达水平的影响

    3.1 不同NFC/NDF饲粮对肉牛肌肉氨基酸组成的影响动物对饲粮中蛋白质的吸收利用本质上是对氨基酸的吸收利用，通过饲粮摄取的氨基酸的种类和含量决定着蛋白质的营养价值，而饲粮提供的各种氨基酸的平衡性影响着蛋白质的吸收利用，饲粮结构和动物的品种影响肌肉中氨基酸的种类和含量[17]。本试验结果显示，高精料(HCD)组中的氨基酸含量普遍高于低精料(LCD)组。谷氨酸和天冬氨酸可与还原糖相结合发生一定的化学反应从而产生香味[18]。另据报道，天冬氨酸、谷氨酸、异亮氨酸等几种鲜味氨基酸的含量跟饲粮中精粗比的含量呈显著的正相关[19]，这与我们的研究结果中HCD组天冬氨酸、谷氨酸、异亮氨酸显著高于LCD组相一致。而甜味氨基酸中苏氨酸、丝氨酸、赖氨酸在HCD组中均高于LCD组；
    芳香族类氨基酸苯丙氨酸和酪氨酸在HCD组中也高于LCD组，鲜味氨基酸、甜味氨基酸和芳香类氨基酸这3大类氨基酸与牛肉风味有关，也是决定肉品质的重要因子[20]。本试验结果表明，鲜味氨基酸、甜味氨基酸、芳香族类氨基酸以及总氨基酸含量HCD组均高于LCD组，并且在以上氨基酸中,对肉的风味影响最大的是谷氨酸,含量的高低与肌肉品质呈显著的正相关，而谷氨酸也在HCD组含量最高，这也说明HCD组饲粮相比于LCD组，提高了牛肉的品质，改善了牛肉风味。氨基酸不仅在肉品质方面发挥重要作用，对机体的正常生长发育也发挥这不可替代的功能。氨基酸可以作为机体代谢过程中的中间体或者信号分子，协调参与机体多种重要的生理过程[21]。支链氨基酸是动物体中不能合成必须从饲料中获得的氨基酸，包括：缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸，大量的研究表明支链氨基酸有多种生物学功能，最重要的功能是调控机体肌肉中蛋白质合成[22]。亮氨酸以及代谢产物通过激活mTOR/S6K1信号通路，促进机体蛋白质合成[23]。支链氨基酸可以通过刺激mTOR靶点，与活性蛋白互作，促进mRNA翻译来刺激肌蛋白合成和沉积，提高机体蛋白质的利用效率，减少氮沉积[24]。研究表明，在低蛋白饲粮中添加支链氨基酸，可以提高肌肉中氨基酸的含量，氨基酸通过增加肌肉蛋白合成、抑制蛋白质降解，促进肌肉生长，提高生产性能[25]。由此可见，饲粮中高NFC/NDF的比值，不仅提高了肉牛肌肉中单个有重要功能氨基酸的含量，还提高了总氨基酸含量，这也说明无论是肌肉的风味还是机体的生产性能都得到了极显著的正反馈，利于肉牛的生长。

    3.2 不同NFC/NDF饲粮对肌肉蛋白质合成基因mRNA表达量以及蛋白表达水平的影响本试验结果显示，饲粮中不同NFC/NDF比例影响反刍动物蛋白质基因的表达，HCD组IGF-1的mRNA表达量显著高于LCD组。IGF-1刺激牛骨骼肌中蛋白质的合成，可以提高肌肉中蛋白质的合成效率[26]。由于HCD组肌肉中支链氨基酸含量显著提高，因此本试验测定了和支链氨基酸代谢相关基因的表达水平，结果显示HCD组与支链氨基酸代谢相关基因BCKDHA、BCAT和SLC38A2基因表达水平显著高于LCD组，与HCD组肌肉中支链氨基酸含量显著高于LCD组相一致。支链氨基酸(BCAA)亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、缬氨酸(Val)，已经作为信号分子出现，可以直接激活雷帕霉素复合体(mTOR)途径的机制靶点，从而调控反刍动物组织蛋白质的合成[27]。以往研究表明，饲喂低蛋白饲粮会通过抑制mTOR信号通路从而减少蛋白质合成[28]。本研究结果显示，LCD组相比于HCD组显著降低了mTOR蛋白表达水平，与以往的研究结果相一致。HCD组促进了p-mTOR、p-4EBP和S6K1基因磷酸化，因为HCD组显著增加了肌肉中亮氨酸浓度。亮氨酸作为反刍动物的必需氨基酸，可以调节机体的蛋白质代谢，促进肌肉蛋白质合成[29]。而mTOR信号通路在蛋白质合成和促进细胞翻译中发挥重要作用[30]。这可能是亮氨酸进一步激活了mTOR信号通路，促进了下游因子S6K1和4E-BP1磷酸化，从而促进肌肉中蛋白质的合成[31]。

    FOX是一种重要的转录调节蛋白，可以调控肌肉蛋白质降解，近年来不断有新的亚型被报道。FOX蛋白对基因的转录调控有2种方式，一种是吸引共激活因子协同调控；
    另一种是直接结合染色体重塑染色体结构，改变相应基因的表达量[32]。该蛋白自身的活性也受其他途径调节，其中较为重要的调节效果是磷酸化反应[33]。FOXO1是FOX家族中最早发现的转录因子，在细胞分化信号和转录级联反应中发挥着重要作用。其后在FOXO1的基因结合结构域同系物研究中发现了FOXO3a，与FOXO1具有高度同源性[34-35]。FOXO1调控机制主要表现在对肉质的调控。在牛羊等动物上均有报道FOXO1通过去磷酸化作用，抑制肌细胞和脂肪细胞的增殖分化，影响肉品质[36]。HCD组FOXO1和p-FOXO3a基因极显著高于LCD组，说明有可能HCD组牛肉品质较好，具体还需要进一步测定肉品质进行验证。FOXO基因在多种组织中具有广泛的表达，发挥了重要的作用，具体怎样在牛的肌肉组织中发挥作用将成为下一步的研究内容：揭示FOXO基因调控肉牛的作用机制。

    本试验结果表明，NFC/NDF比值为4.05的高精料饲粮，肌肉氨基酸含量丰富，肉的风味品质好，营养价值高；
    还能够提高mTOR通路中S6K1磷酸化水平,促进肌肉蛋白质合成，提高蛋白质的利用效率。

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