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    麋鹿角药材物质表征及分析

    时间：2023-01-16 16:35:09 来源：东东创业网 本文已影响人 东东创业网手机站

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    (1.南京中医药大学/中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程研究中心/江苏省中药资源产业化过程协同创新中心/国家中医药管理局中药资源循环利用重点研究室,江苏 南京 210023;2.江苏省海洋药用生物资源研究与开发重点实验室,江苏 南京 210023;3.中国中医科学院中药研究所,北京 100700;4.江苏大丰麋鹿国家级自然保护区,江苏 大丰 224136;5.北京麋鹿生态实验中心,北京 100076;6.湖北石首麋鹿国家级自然保护区,湖北 石首 434407;7.江苏省溱湖国家湿地公园麋鹿苑,江苏 泰州 225500)

    麋鹿角为鹿科麋鹿属麋鹿ElaphurusdavidianusMillne-Edwards雄鹿已骨化的角,是珍贵的传统中药,在本草中多有记载。据《中华本草》,麋鹿角可“温肾壮阳,填精补髓,强筋骨,益血脉”,主治“肾阳不足,虚劳精亏,腰膝酸软,筋骨疼痛,血虚证”[1]。

    麋鹿种群曾一度在中国境内绝迹,导致麋鹿角药材药用历史断代。近年来,随着中国境内麋鹿资源分布区域不断扩张和种群持续壮大[2],自行脱落的麋鹿角资源产量逐年递增且形成大量库存。从资源学角度看,人类对生物资源保护的目的是为了能够持续有效地服务于人们的生产与生活,满足人们健康需求。长期人工驯养繁衍的麋鹿产生的脱落角,既有深厚的传统中医药用历史和功效记载,又有现代科学证据,若不加以积极主动地研究与合理利用,必将造成中国这一特有鹿科药用资源的极大浪费,也不符合“传承精华,守正创新”的发展战略思想。因此,本课题组近20年持续对麋鹿角传统功效及其物质基础进行了较为系统的科学表征研究,为恢复麋鹿角的法定药用地位开展了前瞻性基础研究,为明确麋鹿角的物质组成及特征,为其资源合理利用以及质量标准评价和控制提供科学依据。

    本文是在前期研究的基础上[3-5],鉴于以往研究报道所涉及麋鹿角样品的局限性及所表征的物质信息不足等,收集了麋鹿分布代表性区域的39批麋鹿角样品进行多指标物质表征和分析,以期为麋鹿角的物质组成提供较为全面的信息,同时揭示麋鹿角样品的区域特征,为麋鹿角的深入研究和资源利用提供参考。

    1.1 实验药材

    麋鹿角样品,共39批次(表1),收集于江苏大丰、江苏溱湖、北京、湖北石首地区。经江苏省大丰麋鹿国家级自然保护区丁玉华主任鉴定,确证为鹿科动物麋鹿ElaphurusdavidianusMilne-Edwards雄鹿已骨化的角。凭证标本存于南京中医药大学中药资源产业化过程协同创新中心。

    表1 麋鹿角样品信息

    1.2 实验试剂

    含有锂(Li)、铍(Be)、硼(B)、镁(Mg)、铝(Al)、钛(Ti)、钒(V)、铬(Cr)、锰(Mn)、铁(Fe)、钴(Co)、镍(Ni)、铜(Cu)、锌(Zn)、镓(Ga)、砷(As)、锶(Sr)、镉(Cd)、锡(Sn)、锑(Sb)、钡(Ba)、铊(Tl)、铅(Pb)和铋(Bi)的多元素标准溶液(100 μg·mL-1)(批号:GSB 04-1767-2004)和含有磷(P)(100 μg·mL-1)[批号:GSB 04-1741-2004(a)]、钙(Ca)(100 μg·mL-1)(批号:GSB 04-1720-2004)的多元素标准溶液购自国家有色金属及电子材料分析测试中心;对照品反式-4-羟基-L-脯氨酸(Hpro)、L-丝氨酸(Ser)、L-甘氨酸(Gly)、L-丙氨酸(Ala)、L(+)-精氨酸(Arg)、L-苏氨酸(Thr)、L-脯氨酸(Pro)、L-缬氨酸(Val)、L-异亮氨酸(Ile)、L-亮氨酸(Leu)、L-苯丙氨酸(Phe)、L-赖氨酸(Lys)均购于Sigma公司,经HPLC检测纯度均大于98%;乙腈(HPLC级)购自Merck公司;异硫氰酸苯酯(批号：C10274299)购自南京良纬生物科技有限公司;硝酸(优级纯,批号：180732)、双氧水(优级纯,批号：180827)、三乙胺、盐酸和正己烷均购自国药控股化学试剂有限公司;牛血清白蛋白(BSA,纯度≥98%)、考马斯亮蓝G-250购自南京晚晴有限公司。

    1.3 总灰分、酸不溶灰分及水浸出物测定

    取麋鹿角样品,粉碎,过2号筛,于4 ℃低温条件下保存备用。依据2020年版《中国药典》四部通则中灰分测定法(2302)和浸出物测定法(2201)项下水溶性浸出物测定法(热浸法)相关规定对麋鹿角药材进行总灰分、酸不溶性灰分及水溶性浸出物测定。

    1.4 重金属含量测定

    取麋鹿角样品,粉碎,过120目筛,于4 ℃低温条件下保存备用。依次配置测定所需的标准品溶液、供试品溶液,建立仪器测定方法[6],开展麋鹿角重金属含量测定。

    1.5 无机元素测定

    取麋鹿角样品,粉碎,过120目筛,于4 ℃低温条件下保存备用。依次配置测定所需的标准品溶液、供试品溶液,建立仪器测定方法[7],开展麋鹿角无机元素的测定。

    1.6 水溶性蛋白测定

    取麋鹿角样品,粉碎,过120目筛备用。依次配置水溶性蛋白测定所需的标准品溶液、供试品溶液,建立仪器测定方法[8],开展麋鹿角水溶性蛋白测定。

    1.7 水解氨基酸相关的定性分析及指纹图谱特征

    取麋鹿角样品,粉碎,过120目筛,于4 ℃低温条件下保存备用。依次配置水解氨基酸测定所需的标准品溶液、供试品溶液,建立仪器测定方法[9],开展麋鹿角水解氨基酸测定。

    采用Waters InnovationTM300°A C18(4.6 mm×25 cm,5 μm)；
    乙腈-0.1 mol·L-1醋酸钠溶液(用醋酸调节pH值至6.5)(7∶93)为流动相A，以乙腈-水(4∶1)为流动相B进行梯度洗脱；
    流速1.0 mL·min-1,柱温43 ℃,检测波长为254 nm,进样体积:5 μL。

    建立梯度洗脱程序:0～11 min,100%A;11～15 min,100%→85%A;15～25 min,85%→78%A;25～30 min,78%→65%A;30～35 min,65%A→100%B;35～45 min,100%B。

    2.1 总灰分、酸不溶灰分及水浸出物测定

    依据2020年版《中国药典》四部通则相应方法对39批代表性麋鹿角样品进行测定,相关数据详见表2。

    表2 39批麋鹿角总灰分、酸不溶灰分、水浸出物含量(%)

    2.2 重金属含量测定

    使用OptimaTM2100 DV电感耦合等离子体发射光谱仪对麋鹿角样品中Pb、Cu、As和Cd重金属进行测定,具体数据详见表3～4。

    表3 39批麋鹿角中4种重金属含量(μg·g-1)

    表4 不同区域麋鹿角中4种重金属平均含量(μg·g-1)

    2.3 无机元素测定

    采用ICP-MS对麋鹿角样品中的3种常见元素(Mg、P、Ca)、8种必需微量元素(Cr、Mn、Fe、Ni、Zn、Sr、B、V)和其它11种无机元素(Li、Be、Tl、Bi、Ti、Co、Ga、Sn、Ba、Al、Sb)进行定量检测,数据详见表5～10。结合正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)及聚类分析法开展多元统计分析。

    表5 39批麋鹿角样品中常量元素含量(μg·g-1)

    2.3.1 不同地区的麋鹿角无机元素聚类分析 利用SIMCA-P 14.0软件聚类分析,对39批麋鹿角样品中无机元素分析可得(图1),距离为1.6时,可划分为2类。来自江苏大丰和江苏溱湖地区的样品聚为一类,可能与大丰和溱湖的地理位置非常接近有关;来自北京和湖北石首样品聚为另一类,但湖北石首地区的样品聚集紧密。

    2.3.2 不同地区的麋鹿角无机元素OPLS-DA分析 为探讨不同地区麋鹿角无机元素成分含量差异,挖掘可用于区分不同地区的潜在指标成分,本研究将所测定的39批麋鹿角样品中的17种(可测到)化学成分含量导入SIMCA-P 14.0软件进行OPLS-DA分析。如图2A所示,所有样品被分为3类,反映了不同地区的麋鹿角成分存在一定的差异。来自江苏大丰和江苏溱湖的样品相对较近,来自北京和湖北石首的样品相对较近。根据各成分的VIP值(图2B),B、Li、Mn、Al、Ca和V的VIP值均大于1,筛选为主要差异成分,表明这6种成分在江苏大丰、江苏溱湖、北京以及湖北石首地区样品中含量差异较大。

    表6 39批麋鹿角样品中必需微量元素含量(μg·g-1)

    表7 39批麋鹿角样品中其他11种无机元素含量(μg·g-1)

    表8 不同区域麋鹿角中3种常量元素平均含量(μg·g-1)

    表9 不同区域麋鹿角中8种必需微量元素元素平均含量(μg·g-1)

    表10 不同区域麋鹿角中6种其他无机元素平均含量(μg·g-1)

    2.4 水溶性蛋白测定

    采用考马斯亮蓝比色法对麋鹿角样品中水溶性蛋白的含量进行测定,结果见表11。蛋白质平均总含量为68.67 mg·g-1,分析可得各地区麋鹿角蛋白质成分总含量差异较小。

    表11 麋鹿角样品蛋白质成分含量检测结果(mg·g-1,n=3)

    2.5 水解氨基酸定性分析及指纹图谱特征

    氨基酸是角类药材有机成分中含量居首的营养物质,种类繁多,是角类药材的潜在功效物质[8，10-11]。本文拟选用12种酸水解氨基酸作为研究对象,对来自麋鹿角主要分布区的麋鹿角样品进行全面的评估。

    2.5.1 主成分鉴别 以建立的HPLC-UV法分析各供试样品,1～12号峰被分别鉴定为羟脯氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、苏氨酸、脯氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸,结果见图3。

    2.5.2 指纹图谱的建立 采用异硫氰酸苯酯(PITC)HPLC法建立麋鹿角药材的指纹图谱,共匹配出12个共有峰,结果见图4。

    将38批麋鹿角样品所得色谱数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》,采用中位数法计算38批麋鹿角药材相似度,发现所有样品的相似度均大于0.9,表明不同地区间麋鹿角药材的氨基酸组成相似。

    本研究对39批麋鹿角药材进行总灰分、酸不溶性灰分及水浸出物等相关理化数据测定。结果显示,麋鹿角总灰分含量范围为:49.71%～62.40%,酸不溶性灰分含量范围为:21.73%～39.54%,水溶性浸出物含量范围为:6.18%～16.95%。总灰分及酸不溶性灰分检查项的含量偏高,与麋鹿角生长时期、骨化程度有关。重金属含量测定结果显示Pb、Cu及As的总含量范围为0.67～197.29 μg·g-1,其中,Pb含量范围为0.01～7.63 μg·g-1;Cu含量范围为0.05～190.14 μg·g-1;As含量范围为0.02～1.31 μg·g-1,所有麋鹿角样品均不含有Cd。分析发现不同地区麋鹿角种群之间重金属元素存在一定差异,其中北京地区麋鹿角样品中Pb和Cu平均含量相较于其它地区较高,这可能与麋鹿的栖息环境、饮食和水密切相关[6]。

    分析39批麋鹿角样品中无机元素的检测结果发现,麋鹿角样品中Ca含量最高(5.17～40.66 mg·g-1),P含量次之(2.08～18.95 mg·g-1);必需微量元素中Sr含量(17.31～432.97 μg·g-1)和Fe含量(2.26～305.03 μg·g-1)较高,Cr、V含量最低,只有个别样品可以检测到;其它11种无机元素中,Al含量较高(15.65～337.51 μg·g-1)。所有样品均未检测到Be、Tl、Bi、Co和Sb。就江苏大丰麋鹿角中无机元素的含量测定结果而言,本次研究与宋建平等的研究结果基本保持一致[7]。

    研究表明，麋鹿角中富含氨基酸类成分[9],进一步比较分析发现北京地区麋鹿角样品富含谷氨酸,江苏溱湖地区麋鹿角样品富含甲硫氨酸,而湖北石首地区麋鹿角样品富含异亮氨酸。揭示出所有麋鹿角样品呈现区域特征性且其氨基酸类成分的积累与生境密切相关,为麋鹿角药材的综合利用提供了科学参考。

    不同于过往研究报道中麋鹿角样品收集区域范围小及样本量少的情况[6-7,10],本研究基于覆盖麋鹿主要分布区的麋鹿角样品,对其进行包括灰分、水浸出物、重金属、无机元素及水解氨基酸指纹图谱等全面的物质表征研究,明确了不同区域麋鹿角药材间物质成分的差异,揭示出麋鹿角样品呈现区域特征性,为麋鹿角药材质量标准的制定以及麋鹿角的资源化利用提供了较全面的物质组成依据。

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